多重微球流式熒光免疫技術檢測抗核抗體譜的評價與臨床應用①

尚曉瑩 于 騰 孫桂榮 姚 遠 張麗君 賀俠琴 劉明軍

(青島大學附屬醫院檢驗科,青島266003)

抗核抗體(Antinuclear antibodies，ANA)的檢測對自身免疫病(Autoimmune disease，AID)的診斷、病情評估與治療監測等具有重要的臨床價值。目前ANA的檢測方法主要為間接免疫熒光法(Indirect immunofluorescence，IIF)；抗核抗體譜的檢測方法主要為免疫印跡法(Immunoblot，IB)和ELISA法，均有自動化程度低、僅為定性和半定量檢測等局限性。一些自身抗體(如抗dsDNA抗體、抗核小體抗體等)濃度的變化可以反映病情變化或藥物療效情況，而對這些自身抗體濃度變化的監測需要采用定量檢測[1-3]。多重微球流式熒光免疫技術(Multiplex bead-based flow fluorescent immunoassay， MBFFI，簡稱：流式熒光免疫法)是一種以熒光編碼微球為核心，集流式細胞、激光分析、高速數字信號處理等多種技術于一體的多指標并行分析技術平臺，可一次同時準確定量檢測100種不同的生物分子；具有高通量、高靈敏度、高自動化、穩定性好等優點[4]。本研究是通過流式熒光免疫法檢測自身免疫病的抗核抗體譜，并與免疫印跡技術、IIF等傳統檢測方法相比較，對流式熒光免疫法檢測抗核抗體譜的結果進行分析和評價。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標本來源 2017年11月至2018年3月在青島大學附屬醫院就診并臨床確診的自身免疫病患者的血清標本共333例，同時選取排除自身免疫病的其他疾病患者血清44例(其他疾病組)和健康體檢者血清59例(對照組)。

1.1.2材料 流式熒光免疫法所用試劑及TESMI F3999全自動加樣儀由上海透景生命科技有限公司提供，Luminex?200TM流式點陣儀為美國Luminex公司生產。免疫印跡法試劑及EUROBlotMasterⅡ免疫印跡儀購自德國歐蒙公司。間接免疫熒光法所用抗原基質片(靶抗原為Hep-2細胞與猴肝組織)及試劑購自德國歐蒙公司。

1.2方法

1.2.1標本采集 受檢者空腹采靜脈血，離心分離血清，于當天以免疫印跡法檢測抗核抗體譜及IIF法檢測ANA，另分裝一份-36℃冰箱保存，流式熒光免疫法檢測前復融至室溫。

1.2.2抗核抗體譜檢測 抗核抗體譜包括的項目有：抗線粒體抗體M2型(AMA-M2)，抗著絲粒抗體(anti-Centromere),抗組蛋白抗體(anti-Histone),抗細胞漿組酰-tRNA合成酶抗體(anti-Jo-1)，抗核小體抗體(anti-nucleosome,anti-Nucl)，抗多肽復合體抗體(anti-PM-Scl),抗核糖體P蛋白抗體(anti-ribosomal P,anti-Rib-P),抗Robert抗原52抗體(anti-Ro52)，抗干燥綜合征A抗體(anti-SSA)，抗干燥綜合征B抗體(anti-SSB)，抗DNA拓撲異構酶Ⅰ抗體(anti-Scl-70),抗雙鏈DNA抗體(anti-dsDNA)，抗核糖核蛋白抗體(anti-RNP),抗Smith抗體(anti-Sm)。流式熒光免疫法檢測步驟：血清加載在TESMI F3999全自動加樣儀后進行樣本處理，后進入Luminex?200TM流式點陣儀檢測和數據處理。dsDNA的Cut-off值為18 U/ml，其余指標的Cut-off值為1 AI(AI=抗體指數)。免疫印跡法檢測步驟：將膜條放入免疫印跡儀的溫育槽中，經過5 min樣本緩沖液溫育后，加入1∶100稀釋的血清，室溫溫育30 min后清洗，再加入酶結合物，溫育30 min后清洗，加入底物液，溫育10 min后清洗，風干后放置于掃描儀中，EUROLineScan軟件判讀陰陽性結果。

1.2.3ANA檢測 采用間接免疫熒光法。血清1∶100 稀釋，滴加25 μl于抗原基質片上，溫育30 min后清洗，再滴加25 μl FITC標記的熒光二抗于抗原基質片上，溫育30 min后清洗，封片，熒光顯微鏡下判讀陰陽性結果。

1.3統計學處理 采用SPSS24.0統計學軟件進行統計學分析。兩種檢測技術結果的一致性行Kappa檢驗，Kappa值≤0.4表明一致性差，0.4

2 結果

2.1流式熒光免疫法與免疫印跡法檢測所有標本的總體一致性比較 以MBFFI或IB法檢測抗核抗體譜的各指標中有一項及以上為陽性者，判為此標本的抗核抗體檢測陽性；各指標均為陰性，判為此標本的抗核抗體檢測陰性，并由此計算MBFFI或IB法檢測ANA的靈敏度、特異度[5-7]。用兩種方法對總共436例標本進行檢測，兩種方法的一致率為83.26%，Kappa值=0.655，結果見表1。

2.2流式熒光免疫法與免疫印跡法檢測各組各項目的一致性比較 病例組中各項目一致率在79.88%至99.40%之間，Kappa值在0.106至0.958之間，其中抗Centromere一致性最好(Kappa值=0.958)，抗Scl-70一致性最差(Kappa值=0.106)。對照組中各項目一致率在96.61%至100.00%之間，其他疾病組中各項目一致率在95.45%至100.00%之間。結果見表2、3。

2.3三種方法診斷自身免疫病的靈敏度、特異度比較 間接免疫熒光法的靈敏度最高，免疫印跡法、間接免疫熒光法分別與流式熒光免疫法比較，靈敏度的差異有統計學意義(P<0.01，P<0.01)。流式熒光免疫法的特異度最高，免疫印跡法、間接免疫熒光法分別與流式熒光免疫法比較，特異度的差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。流式熒光免疫法與間接免疫熒光法聯合檢測的靈敏度比流式熒光免疫法單獨檢測高，差異有統計學意義(P<0.01)。免疫印跡法與間接免疫熒光法聯合檢測的靈敏度比免疫印跡法單獨檢測高，差異有統計學意義(P<0.01),結果見表4。流式熒光免疫法、免疫印跡法、流式熒光免疫法與間接免疫熒光法聯合檢測及免疫印跡法與間接免疫熒光法聯合檢測的約登指數分別為0.686、0.660、0.706及0.633。

表1所有標本流式熒光免疫法與免疫印跡法檢測結果(n)

Tab.1ResultsforallsamplesbyMBFFIandimmunoblot(n)

IBPositiveNegativeTotalMBFFIPositive22319242Negative54140194Total277159436

表2病例組流式熒光免疫法與免疫印跡法檢測各項目比較

Tab.2ComparisonofresultsforeachitembyMBFFIandimmunoblotinAIDpatients

AntigenPositive rateMBFFIIBConcordance rateKappacoefficientAMA-M212.91%2.40%88.29%0.203Centromere7.51%8.11%99.40%0.958Histone22.52%13.21%79.88%0.324Jo-11.50%2.40%98.50%0.608Nucl11.41%16.52%92.49%0.689PM-Scl7.51%3.90%90.39%0.112Rib-P9.31%11.41%96.70%0.822Ro-5243.84%48.35%93.09%0.861SSA36.64%43.84%91.59%0.826SSB13.51%14.11%93.99%0.748Scl-7014.41%2.40%85.59%0.106dsDNA21.92%9.31%83.78%0.403RNP17.72%20.72%88.59%0.633Sm12.31%7.51%93.99%0.666

3 討論

抗核抗體檢測對AID的診斷、病情評估和療效監測具有重要價值，多種抗核抗體檢測已列入AID的診斷標準或指南中[8-11]，如抗dsDNA抗體、抗Sm抗體已列入SLE的診斷標準[8]；抗SSA、SSB抗體已列入干燥綜合征的診斷標準[9]。目前抗核抗體及抗核抗體譜的檢測方法：IIF、免疫印跡法和ELISA，均有一定的局限性。IIF因為對核型和滴度的鑒定有主觀性，使得各實驗室之間的結果很難取得一致性，且自動化程度低，僅為定性檢測。免疫印跡法及ELISA主要用于特異性抗體的鑒定，但均為定性或半定量檢測且自動化程度不高。流式熒光免疫法可彌補上述方法的不足，且可定量檢測特異性自身抗體，從而可評估某種特異性自身抗體對AID病情變化、療效監測的價值。本研究中，流式熒光免疫法與免疫印跡法總體一致性一般。病例組中大部分項目兩種檢測方法的一致性較高(14項中9項的Kappa值在0.6以上，5項在0.7以上)。一致性最好的為抗Centromere，一致性最差的為抗Scl-70。抗Scl-70被認為是系統性硬化病的標記性抗體[12]。本研究沒有具體統計各病種的抗Scl-70陽性率，可能系統性硬化病兩種檢測方法的陽性率差異大致相同，而其他自身免疫病的兩種檢測方法的陽性率差異較大導致的一致率差。AMA-M2是原發性膽汁性肝硬化的血清診斷標志抗體，其一致性差的可能原因同抗Scl-70[13]。抗PM-Scl的一致性亦較差，可能兩種方法檢測此項的陽性率均很低所致。對照組及其他疾病組兩種方法一致性很高且陽性率很低。

表4流式熒光免疫法、免疫印跡法及間接免疫熒光法靈敏度、特異度比較

Tab.4ComparisonofsensitivityandspecificitybetweenMBFFI,IBandIIF

MethodsSensitivity(%)Specificity(%)IB79.61)86.42)MBFFI70.398.3IIF92.81)3)76.31)MBFFI+IIF94.31)76.31)IB+IIF95.53)67.83)

Note：Compared with MBFFI,1)P<0.01,2)P<0.05;compared with IB,3)P<0.01.

表3對照組及其他疾病組流式熒光免疫法與免疫印跡法檢測各項目比較

Tab.3ComparisonofresultsforeachitembyMBFFIandimmunoblotincontrolsandotherdiseases

AntigenControlsPositive rateMBFFIIBConcordancerateOther diseasesPositive rateMBFFIIBConcordancerateAMA-M20.00%0.00%100.00%2.27%0.00%97.73%Centromere0.00%0.00%100.00%0.00%0.00%100.00%Histone0.00%1.69%98.31%4.55%0.00%95.45%Jo-10.00%0.00%100.00%0.00%0.00%100.00%Nucl0.00%0.00%100.00%0.00%0.00%100.00%PM-Scl0.00%3.39%96.61%0.00%0.00%100.00%Rib-P0.00%0.00%100.00%0.00%2.27%97.73%Ro-520.00%3.39%96.61%4.55%2.27%97.73%SSA0.00%0.00%100.00%2.27%2.27%95.45%SSB0.00%0.00%100.00%2.27%0.00%97.73%Scl-701.69%1.69%96.61%4.55%0.00%95.45%dsDNA0.00%0.00%100.00%4.55%0.00%95.45%RNP0.00%3.39%96.61%0.00%2.27%97.73%Sm0.00%1.69%98.31%0.00%0.00%100.00%

IIF檢測ANA的熒光核型具有一定的提示作用，但一種自身抗體可出現不同的熒光核型，不同的自身抗體也可出現相同的熒光核型，不能僅從熒光核型來推斷特異性自身抗體種類[3]。免疫印跡法所用的抗原必須是純化的抗原，才能保證被測定抗體的準確性和特異性，但目前許多自身抗體的確切抗原不明確且不易被純化，僅有少部分抗原有純化的產品能用于特異性檢測[14]。專家共識建議：臨床應用中可先用IIF法檢測ANA，若為陽性，需進一步檢測特異性自身抗體[3]。本研究顯示，流式熒光免疫法的診斷靈敏度雖然低于免疫印跡法與IIF法，但特異度高于后兩者，而IIF法檢測ANA的靈敏度高于其余兩方法。本研究中流式熒光免疫法與IIF法不一致的結果中5.88%為流式熒光免疫法陽性且IIF法陰性，與Nifli等[7]的研究不一致，其為77.04%。原因是本研究所用流式熒光免疫法的試劑不再添加Hep-2抗原成分，Hep-2為IIF靶抗原，從而降低了靈敏度但提高了特異度。流式熒光免疫法與IIF法聯合檢測的靈敏度比流式熒光免疫法單獨檢測高。這恰好提示：IIF檢測ANA作為初篩試驗目前仍是最好的，而流式熒光免疫法可替代免疫印跡法檢測ANA作為確認試驗。

綜上所述，流式熒光免疫法檢測抗核抗體譜與傳統的免疫印跡法相比，一致性尚可，特異度更高，與IIF組合應用更符合臨床需求。且流式熒光免疫法自動化程度更高，檢測速度更快，對某些特異性自身抗體可定量檢測從而監測病情變化。流式熒光免疫法可替代免疫印跡法成為新一代的特異性自身抗體確認試驗檢測方法。