宮頸癌組織中SALL3、DNMT3A、甲基化SALL3基因表達觀察

趙娟，魏星，楊婷，趙敏伊，楊筱鳳

(1 西安交通大學第一附屬醫院，西安710061；2 西安交通大學第二附屬醫院)

宮頸癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤之一。研究[1]顯示，我國每年新發病例數達13.1萬，死亡例數達5.3萬，占所有女性惡性腫瘤的18%。近年來，宮頸癌新的診斷和治療技術得到不斷發展，但患者的5年總體生存率僅在40%左右，因此明確宮頸癌發生發展的機制，尋找宮頸癌早期診斷指標及治療方案具有重要的臨床意義[2]。研究[3]表明，表觀遺傳學調控如甲基化、乙酰化、糖基化等，參與了宮頸癌的發生發展。DNA甲基化修飾在基因表達調控過程中發揮重要作用，DNA甲基化是在DNA甲基轉移酶(DNMT)催化下，以S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，使CpG島中5′端胞嘧啶甲基化，而CpG島多位于基因啟動子附近，因此DNA甲基化后將抑制基因轉錄。DNMT家族包括DNA甲基化維持酶(DNMT1)、DNA甲基轉移酶3A(DNMT3A)和DNA甲基轉移酶3B(DNMT3B)3個成員，在DNA甲基化的啟動和維持中發揮重要作用。研究[4]顯示，DNMT3A在多種腫瘤中高表達，可通過直接或協同作用導致抑癌基因異常甲基化而沉默其表達。spalt樣轉錄因子3(SALL3)是SAL基因家族的成員，位于染色體18q23，SALL3基因編碼產生含有4個鋅指結構的轉錄因子。研究[5]顯示，SALL3基因啟動子在腫瘤發生時存在異常甲基化現象，導致SALL3基因表達水平降低。研究[6]發現，SALL3能通過雙鋅指結構域與DNMT3A的PWWP結構域結合，抑制DNMT3A，而在腫瘤發生時SALL3表達降低，導致抑制DNMT3A能力下降，DNMT3A活性增強后進而抑制抑癌基因的表達，促進腫瘤的發生發展。目前有關宮頸癌中SALL3及DNMT3A表達的研究較少。本研究觀察了宮頸癌組織中SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA及甲基化SALL3基因表達情況，分析SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA表達的相關性及其與宮頸癌患者臨床病理參數的關系，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年12月～2018年12月西安交通大學第一附屬醫院診治的宮頸癌患者200例，患者年齡27～56歲，平均(42.9±7.1)歲，其中宮頸鱗癌161例、子宮腺癌39例，腫瘤高分化57例、中分化65例、低分化78例，腫瘤分期Ⅰ期112例、Ⅱ期88例[7]，淺肌層浸潤81例、深肌層浸潤119例，淋巴結轉移117例、無淋巴結轉移83例。納入標準：①均經宮頸活檢病理或術后病理檢查確診為宮頸癌；②均為初次診治，既往未接受其它抗腫瘤治療；③臨床病理資料完整，患者及家屬均知情同意并已簽署知情同意書。排除標準：①合并其它器官系統的惡性腫瘤；②合并急性感染性疾病，如上呼吸道感染等；③合并嚴重的臟器功能不全，如心功能衰竭、肝功能衰竭等。選取同期接受手術治療的子宮肌瘤患者40例，患者年齡34～56歲，平均(42.1±6.8)歲。本研究中，200例宮頸癌患者與40例子宮肌瘤患者年齡間無顯著差異(P>0.05)。患者均接受手術切除治療，宮頸癌患者術中留取宮頸癌組織，子宮肌瘤患者術中留取正常宮頸組織，留取的組織標本迅速置于凍存管內，液氮速凍后，置于-80℃冰箱保存。

1.2 宮頸癌組織及正常宮頸組織中SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA檢測方法 采用qRT-PCR法。取約30 mg組織標本，TRIzol法提取總RNA，溶于80 μL無RNA酶的ddH2O中，核酸蛋白測定儀上檢測RNA濃度。以2 μg總RNA為模板，逆轉錄合成cDNA，總反應體系為20 μL，實驗步驟嚴格按照逆轉錄試劑盒說明書進行。以cDNA為模板，進行熒光定量PCR反應。引物序列如下：SALL3正向引物為5′-CCAATGTGTCGGTGTTCGAG-3′，反向引物為5′-CCGGGTAAGGGTTCATCTGG-3′；DNMT3A正向引物為5′-CCGATGCTGGGGACAAGAAT-3′，反向引物為5′-CCCGTCATCCACCAAGACAC-3′；內參基因GAPDH正向引物為5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反向引物為3′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-5′。熒光定量PCR反應條件為：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，40個循環。所有反應均在ABI實時定量PCR儀上完成，每個樣本重復3次。以2-ΔCt表示目的基因的相對表達量。

1.3 宮頸癌組織及正常宮頸組織中甲基化SALL3基因表達觀察 應用酚-氯仿法提取、純化組織DNA，實驗步驟按照TaKaRa Mini DNA 提取試劑盒說明書進行，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。應用亞硫酸氫鈉修飾提取的500 ng基因組DNA，以將DNA中尚未甲基化的胞嘧啶(C)修飾為尿嘧啶(U)，操作步驟按照EZ DNA Methylation-Gold Kit說明書進行，然后進行甲基化特異PCR擴增。引物序列如下：SALL3基因甲基化正向引物：5′-ATTTTAGAATGGAAGGGAGTTCGTC-3′,反向引物：5′-ATAACCTCCTAAAACTTCCCCGAA-3′；SALL3基因非甲基化正向引物：5′-ATTTTAGAATGGAAGGGAGTTTGTTG-3′,反向引物：5′-AAATAACCTCCTAAAACTTCCCCAAA-3′。PCR反應體系根據PCR反應試劑盒說明進行。PCR反應條件為：95 ℃預變性10 min；然后進行40個循環的擴增反應，程序為95 ℃變性30 s，51 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s；72 ℃延伸8 min，4 ℃保溫。PCR反應結束后取10 μL反應產物，應用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，以去離子水為陰性對照，應用成像分析系統照相，根據DNA條帶判斷結果。甲基化陽性結果判斷方法：甲基化引物擴增出目的條帶，而非甲基化引物未擴增出目的條帶；甲基化陰性結果判斷方法：甲基化引物未擴增出目的條帶，而非甲基化引物擴增出目的條帶。用圖像分析系統計算受檢標本的甲基化條帶密度值，即為標本的相對甲基化程度。

2 結果

2.1 宮頸癌組織與正常宮頸組織中SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA表達比較 宮頸癌組織中SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA相對表達量分別為0.253±0.051、0.272±0.055，正常宮頸組織中SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA相對表達量分別為1.050±0.062、0.093±0.016，兩者相比，P均<0.05。

2.2 宮頸癌組織中SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA表達的相關性 宮頸癌組織中SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA表達呈負相關(r=-0.679，P=0.000)。

2.3 SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA表達與宮頸癌患者臨床病理參數的關系 結果見表1。表1顯示，SALL3、DNMT3A mRNA表達與宮頸癌患者FIGO分期、分化程度有關(P均<0.05)。

2.4 宮頸癌組織及正常宮頸組織中甲基化SALL3基因比較 宮頸癌組織中SALL3基因甲基化率為60.5%(121/200)，相對甲基化程度為1.72±0.61；正常宮頸組織中SALL3基因甲基化率為30.0%(12/40)，相對甲基化程度為0.26±0.07；兩者相比，P均<0.05。

3 討論

DNA甲基化是表觀遺傳修飾的最常見形式，通過基因表達調控，參與各種分化發育、炎癥、自身免疫和腫瘤的發生發展過程。研究[8]表明，啟動子區域特別是CpG島異常的DNA甲基化與許多癌癥的發生密切相關。在結直腸癌研究[9]中發現，β-環連蛋白抑制基因2(DACT2)為一種抑癌基因，其基因啟動子區域存在高甲基化的現象，DACT2表達降低可能參與了結直腸癌的發生發展,而DNA高甲基化是DACT2的重要表達調控機制。此外，研究[10]發現，谷胱甘S-轉移酶P1(GSTP1)保護細胞避免DNA損傷和癌細胞形成,GSTP1基因啟動子甲基化可能造成GSTP1基因低表達，GSTP1活性降低導致DNA損傷的敏感性增強和癌變發生的概率增加。因此，腫瘤相關基因的異常甲基化在致癌過程中起重要作用，研究宮頸癌中特異性基因甲基化具有重要意義。

表1 SALL3、DNMT3A mRNA表達與宮頸癌患者臨床病理參數的關系

SALL3是SAL家族的成員，其參與人類多個系統的發育過程，該基因表達缺失患者表現為先天性心臟疾病、精神發育遲滯、生長發育遲緩及肢體畸形等。近年來研究[11]表明，SALL3表達水平與腫瘤的發生發展之間關系密切，在肝細胞癌中，SALL3基因啟動子被DNA甲基化修飾，SALL3高甲基化降低了肝細胞癌中SALL3的表達水平，SALL3的異常高甲基化有助于肝細胞癌的發生。本研究中，宮頸癌組織中SALL3基因表達在mRNA水平上明顯低于正常宮頸組織，表明宮頸癌組織中SALL基因表達降低。進一步分析發現，宮頸癌組織中SALL3 mRNA表達與FIGO分期、腫瘤分化程度有關，FIGO分期越高、分化越低的癌組織中SALL3 mRNA相對表達量越低，表明SALL3 mRNA相對表達量能夠反映宮頸癌病情嚴重程度，有望成為新的腫瘤相關標志物。我們認為，其機制可能是隨著腫瘤進展，腫瘤微環境中IL-7等細胞因子結合細胞表面的IL-7Rα，進而抑制轉錄因子SALL3的表達[12]。此外，SALL基因啟動子區域存在表觀遺傳學修飾的現象，也可降低SALL3基因表達。Yu等[13]在膀胱癌患者尿液中脫落的腫瘤細胞中發現SALL3富含CG的啟動子區域高度甲基化，認為SALL3可能是檢測膀胱癌的新型DNA甲基化標記物。本研究進一步檢測SALL3基因甲基化表達情況，結果顯示宮頸癌組織中SALL3基因甲基化率及相對甲基化程度均顯著高于正常宮頸組織，表明SALL3基因的表觀遺傳學修飾可能參與腫瘤的發生發展，特別是腫瘤的早期階段，因而檢測SALL3基因甲基化情況有可能成為宮頸癌的早期診斷方法。目前SALL3基因異常高甲基化的機制尚不清楚，可能與HPV感染有關。有研究[14]報道，在宮頸癌SiHa、HeLa兩種HPV陽性細胞系中均存在SALL3基因啟動子區域中高甲基化的現象，但在HPV陰性細胞系C33A中SALL3基因在啟動子區域未出現甲基化現象，因而HPV的感染可能參與誘導SALL3基因甲基化，參與相關的致癌機制。

DNMT3A基因編碼DNA甲基轉移酶，是甲基化調節的關鍵酶，參與從頭甲基化過程，DNMT3A蛋白定位于細胞質和細胞核。有研究[15]表明，DNMT3A與異染色質的組分相互作用，包括HP1、HDAC和組蛋白甲基轉移酶，在染色質結構的調節中起重要作用。研究[16]發現，DNMT3A基因突變參與腫瘤的發生發展過程，在25%的急性髓性白血病(AML)患者中常發生DNMT3A基因R882位點突變。本研究中，宮頸癌組織中DNMT3A在mRNA相對表達量上表達明顯高于正常宮頸組織，且宮頸癌組織中DNMT3A mRNA表達與FIGO分期、腫瘤分化程度有關，FIGO分期越高、分化越低的癌組織中DNMT3A mRNA相對表達量越高，提示宮頸癌組織中DNMT3A mRNA表達升高可能參與宮頸癌的病情發展。DNMT3A表達升高的機制尚不清楚，可能與宮頸癌組織中SALL3基因高甲基化后SALL3表達降低，導致SALL3對DNMT3A的抑制作用減弱，DNMT3A的表達上調后促進抑癌基因的從頭甲基化，促進了宮頸癌的發生[13]。本研究中，SALL3與DNMT3A mRNA表達呈顯著負相關，表明兩者可能存在相互作用，有待進一步深入研究。

綜上所述，宮頸癌組織中SALL3 mRNA低表達、DNMT3A mRNA高表達，兩者負相關，SALL3、DNMT3A mRNA表達與宮頸癌FIGO分期、分化程度有關，兩者共同參與宮頸癌的發生發展過程，有希望成為新的診斷、治療及預后評估的腫瘤標志物。宮頸癌組織中SALL3基因甲基化率及相對甲基化程度升高，檢測甲基化SALL3基因情況有可能成為宮頸癌的早期診斷方法。