20例份血清學弱D表型抗凝血液標本的RHD基因型檢測分析

吳麗娜，解金輝，安仕萍，李雙玉

(天津市血液中心，天津300110)

Rh血型系統是國際輸血協會(ISBT)確認的紅細胞血型系統中最復雜、最具多態性的血型系統，其至少由45個獨立的抗原組成，常見的抗原包括D、C、c、E、e 5種抗原，其中D抗原免疫性最強。根據紅細胞D抗原的有無，可分為紅細胞RhD陽性血型和RhD陰性血型。D抗原由1號染色體上的RHD基因編碼，該基因含有10個外顯子。基因缺失、基因交換、堿基變異等均可導致RHD等位基因的形成。研究[1]顯示，RHD等位基因的出現可導致D抗原數量表達下調或部分D表位缺失，RhD表型出現變化，稱為RhD變異型。迄今已發現超過270種RhD變異型[2]，包括部分D表型、弱D表型以及DEL表型[3]。臨床一般采用鹽水介質法鑒定Rh血型，但該方法不能準確區分RhD變異型。在鹽水介質中加入抗-D單克隆抗體后紅細胞反應為無凝集或弱凝集(≤2+)，加入抗球蛋白(AHG)后發生凝集，稱之為血清學弱D表型(SWDP)[4～6]。研究[7]顯示，SWDP與紅細胞膜上或者膜內D抗原中的一種或者多種氨基酸的替換有關，導致了紅細胞表面D抗原表達減少。本研究收集了20例份血清學檢測結果表現為SWDP的標本進行RHD等位基因分型，分析SWDP標本的基因型及各變異型的分布情況。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 SWDP抗凝血液標本及試劑 選取2016～2018年天津市血液中心保存的SWDP抗凝血液標本20例份，均經鹽水介質法、間接抗球蛋白法鑒定為SWDP。RHD等位基因檢測試劑盒購自天津市秀鵬生物技術開發有限公司。

1.2 RHD基因型檢測 在已加入25 μL蛋白酶K的離心管中加入1 mL的SWDP抗凝血液標本，振蕩混勻10 s，加入250 μL細胞裂解液，70 ℃裂解10 min，加入250 μL無水乙醇溶解DNA，將液體轉移至新的收集管，使用Buffer洗脫提取DNA。以DNA為模板，進行序列特異性引物-聚合酶鏈反應(SSP-PCR)擴增。引物序列如下：啟動子+第1外顯子上游引物為5′-CTAGAGCCAAACCCACATCTCCTT-3′，下游引物為5′-AGAAGATGGGGGAATCTTTTTCCT-3′；第2外顯子上游引物為5′-ATTAGCCGGGCACGGTGGCA-3′，下游引物為5′-AAAGGATGCAGGAGGAATGTAGGC-3′；第3外顯子上游引物為5′-GTGCCACTTGACTTGGGACT-3′，下游引物為5′-AGGTCCCTCCTCCAGCAC-3′；第4外顯子上游引物為5′-TGGCAAGAACCTGGACCTTGACTTT-3′，下游引物為5′-TCCTGAACCTGCTCTGTGAAGTGC-3′；第5外顯子上游引物為5′-TACCTTTGAATTAAGCACTTCACAG-3′，下游引物為5′-TTATTGGCTACTTGGTGCC-3′；第6外顯子上游引物為5′-CAAAAACCCATTCTTCCCG-3′，下游引物為5′-ACCCAGCAAGCTGAAGTTGTAGCC-3′；第7外顯子上游引物為5′-TCTCAGCTCACTGCAACCTC-3′，下游引物為5′-GCTTGAAATAGAAGGGAAATGGGAGG-3′；第8外顯子上游引物為5′-CCAGGTTGTTAAGCATTGCTGTACC-3′，下游引物為5′-CACCCGCATGTCAGACTATTTGGC-3′；第9外顯子上游引物為5′-CCAGGTTGTTAAGCATTGCTGTACC-3′，下游引物為5′-CACCCGCATGTCAGACTATTTGGC-3′；第10外顯子上游引物為5′-CAAGAGATCAAGCCAAAATCAGT-3′，下游引物為5′-AGCTTACTGGATGACCACCA-3′。建立10 μL反應體系：樣本DNA為1 μL，dNTP-Buffer工作液9 μL。PCR反應條件：96 ℃ 2 min，96 ℃ 20 s、68 ℃ 60 s(5個循環)，96 ℃ 20 s、65 ℃ 50 s、72 ℃ 45 s(10個循環)，96 ℃ 20 s、62 ℃ 50 s、72 ℃ 25 s(5個循環)，72 ℃ 5 min，4℃保存。PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠圖像分析系統觀察結果。

1.3 RHD基因測序 如采用SSP-PCR法不能確定基因型，則將擴增產物送至天津市秀鵬生物技術有限公司，采用DNA序列分析技術(SBT)進行基因測序，測序結果與GenBank標準RHD基因序列(BN000065)進行比較，確定其基因型。

2 結果

2.1 RHD基因型檢測結果 20例份SWDP抗凝血液標本中，19例份經RHD基因型檢測可以確定其基因型，其中弱D15型RHD等位基因12例份、部分D型RHD等位基因6例份[DⅥ Ⅲ型5例份、DVA(Hus)型1例份]、DEL型RHD等位基因1例份(1 227 G>A)；1例份經SSP-PCR檢測未能確定基因型。

2.2 RHD基因測序結果 未能確定基因型的1例份標本，其RHD基因第8外顯子的1 100號堿基發生T>A的純合突變，見圖1。該突變導致D抗原的第367位氨基酸由異亮氨酸突變為天冬氨酸，該突變點在紅細胞血型抗原突變數據庫中未找到對應的等位基因，為新發現RHD等位基因，其血清學意義暫不明確。

圖1 1例份SWDP抗凝血液標本RHD基因第8外顯子部分測序結果

3 討論

2014年，美國麻醉醫師學會輸血醫學資源委員會對3 100家實驗室關于SWDP結果的檢測方法與報告策略進行了調查，結果顯示，約47%的實驗室將SWDP結果報告為“RhD陽性”，11%的實驗室報告為“RhD陰性”，30%的實驗室報告為“弱D”[8]。他們通過這項調查發現，當SWDP出現的時候，美國缺乏統一的RhD分型評判標準，這直接導致了實驗報告不一致。

研究[5]顯示，SWDP的分布因人種和民族而不同。在歐洲和美國，SWDP是最常見的RhD變異型，SWDP相關的RHD等位基因與同種免疫的關系也多見于對歐洲白人的研究，其中弱D1、2、3型最為多見[7，9，10]，且這3種類型的受血者均無產生同種抗-D風險，可按RhD陽性對待[11，12]。與歐美國家不同的是，在SWDP相關的RHD等位基因中，弱D15型在中國人中最為常見。本研究的20例份SWDP抗凝血液標本中，共檢測出弱D15型RHD等位基因12例份，占60%。本研究樣本數雖不足以有效地統計分析中國人群中弱D表型RHD等位基因的分布頻率，但足以發現歐洲人群和中國人群弱D表型的分子機理存在較大差異。

研究[7]顯示，部分D表型與紅細胞表面D蛋白氨基酸的替換有關，導致紅細胞缺乏某些D抗原表位。部分D表型的人輸注RhD陽性血液時產生抗-D的比例尚未得知，但是已有被誤認為RhD陽性其實可能為部分D型的人產生抗-D抗體的報道[13]，而這些產生抗-D抗體的人是弱D表型還是部分D表型并沒有被區分。DⅥ型是歐洲人中最常見的部分D表型的基因型之一[14]。研究[15]發現，目前確認的DⅥ表型都是RHD和RHCE基因轉換引起，并非RHD外顯子的缺失，與本研究結果一致。如果將DⅥ型血液當做RhD陰性血液輸注給RhD陰性人群，則有可能導致溶血性輸血反應的發生。研究[16]顯示，攜帶部分D基因的女性患者產生抗-D抗體以后發生了非常嚴重的溶血性輸血反應。目前美國食品藥品監督管理局規定現行的單克隆IgM抗-D試劑需有效避免DⅥ型的檢出。本研究檢出部分D型6例份，其中DⅥ Ⅲ型5例份、DVA(Hus)型1例份，占比較高。

DEL表型通常情況下在血清學實驗中表現為RhD陰性，只有進行吸收放散實驗才能夠檢出[17]。DEL表型在白人和黑人中罕見[18]，但在中國RhD陰性漢族人群中常見，約占30%[19]。中國漢族人群中DEL等位基因主要是RHD 1 227 G>A。一些研究[20,21]認為，DEL表型的受血者由于紅細胞表面的D抗原數目較少，輸注DEL表型的血液不會引起同種免疫的發生。然而，已有許多的報道[22]證實，RhD陰性志愿者輸注DEL表型的血液后會產生同種免疫，通常認為這種免疫為二次免疫，即輸注DEL表型的血液導致已存在抗-D抗體的病人抗-D抗體效價增高。本研究檢出DEL型RHD等位基因1例份，為RHD 1 227 G>A等位基因，與報道的較常見的DEL等位基因型一致。

本研究中，1例份SWDP抗凝血液標本經SSP-PCR檢測未能確定其基因型，進行基因測序進一步確定其基因型。經基因測序發現，RHD基因的第8外顯子的1 100號堿基發生T>A的純合突變，導致D抗原的第367位氨基酸由異亮氨酸突變為天冬氨酸，蛋白質一級結構發生變化，導致D抗原在與抗-D單克隆血清反應時為陰性反應，間接抗球蛋白實驗為陽性反應，其血清學反應結果與部分D表型較為相似。此點突變是否導致了D抗原的數量或者抗原決定簇的改變需要進一步研究，從而探討其是否能夠引起同種免疫，接下來我們將對該新基因攜帶者進行家系調查，檢測其是否能夠穩定遺傳。

綜上所述，本研究20例份SWDP抗凝血液標本中弱D15型和DⅥ型RHD等位基因較多。本研究新發現1例RHD等位基因。RHD基因型的檢測及其能否導致同種免疫的發生,已成為近年來國際免疫血液學領域中研究熱點之一[23]。西方國家已經開始對RHD基因分型進行研究調查，我國SWDP的分布與西方不同，應大力開展RHD基因分型和相關研究，探明SWDP發生率及其基因型分布，條件成熟時建立符合我國國情的RHD的基因分型處理指南。