川陳皮素對MC3T3-E1細胞成骨分化影響的實驗研究*

李 強 蘭庭超 盧 蕓 陳 靜

傳統中藥應用于骨代謝疾病治療已有上千年歷 史，目前認為，傳統中藥具有促進骨形成及抑制骨吸收的雙重作用，其活性成分通過多靶點協同調控骨穩態關鍵轉錄因子發揮作用[1,2]。川陳皮素是傳統中藥陳皮中的主要活性物質，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎及調節免疫等多種生物活性[3,4]。有研究表明，川陳皮素能通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK)信號通路抑制破骨細胞成熟，促進去卵巢小鼠骨形成，降低實驗性牙周炎引起的牙槽骨骨吸收[5,6]。目前，川陳皮素對成骨細胞分化的作用及機制尚不清楚。本研究將以小鼠前體成骨細胞MC3T3-E1為細胞模型，探討川陳皮素對成骨細胞分化的作用及相關機制。

1.材料與方法

1.1 主要試劑與設備 MC3T3-E1細胞(中科院細胞所，中國)，α-MEM培養基(Hyclone，美國)，胎牛血清(四季青，中國)，CCK-8(同仁化學，日本)，堿性磷酸酶活性檢測試劑盒(碧云天，中國)，RT-PCR試劑盒(TaKaRa，日本)，BMP-2信號阻斷劑noggin(CST，美國)，川陳皮素(同田生物，中國)，RT-PCR儀(Bio-rad，德國)。

1.2 MC3T3-E1細胞的培養及傳代 細胞復蘇后，使其接種于培養瓶中，放在37℃、5%CO2條件下的恒溫培養箱中孵育，16～24h后換液，每2～3d更換培養液，待細胞生長融合至80%～90%，進行傳代。α-MEM細胞培養液由α-MEM培養基、10%胎牛血清配制而成。成骨培養基由α-MEM培養基中添加10%胎牛血清、10mM β-甘油磷酸鈉、50μg/ml L-抗壞血酸、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素配制而成。

1.3 CCK-8檢測 川陳皮素(純度為99.5%)用DMSO溶解后，α-MEM培養基稀釋至實驗所需濃度，用于后續細胞實驗(DMSO終濃度＜0.5%)。將MC3T3-E1細胞以4×103細胞/孔密度接種于96孔板，培養24h待細胞貼壁后，分別加入川陳皮素終濃度為0,10-9,10-8,10-7,10-6，10-5M的細胞培養液，每組6個復孔。培養48h后，每孔加入10μl CCK-8檢測液，孵育1h后，抽取150μl上清液用酶標儀測OD 450 nm波長吸光度值。

1.4 堿性磷酸酶(ALP)染色及活性定量檢測將MC3T3-E1細胞以1.5×105細胞/孔密度接種于24孔板，培養24h待細胞貼壁后，分別加入川陳皮素終濃度為 0μM、0.1μM、1μM、10μM 的成骨培養液，每組6個復孔。分別培養10d后進行ALP染色及活性定量檢測。細胞經過PBS漂洗及多聚甲醛固定，使用BCIP/NBT工作液染色后，鏡下觀察并拍照。ALP活性定量檢測使用對硝基苯酚(p-nitrophenol,pNP)法，PBS漂洗細胞后，加入組織裂解液裂解細胞，離心收集細胞蛋白懸浮液，使用p-NP法，酶標儀于405nm波長測定吸光度計算各組樣本的ALP活性值。采用BCA蛋白濃度測定法檢測樣品細胞總蛋白含量：采用倍比稀釋法配制標準溶液，取樣品及標準品測562nm波長OD值，根據標準曲線計算各組樣品細胞總蛋白量。ALP單位活性=ALP活性值/總蛋白質量。

1.5 成骨分化相關基因檢測 將MC3T3-E1細胞以1×105細胞/孔密度接種于24孔板，孵育24h，加入川陳皮素終濃度為0μM、0.1μM、1μM、10μM的成骨培養液，每組3個復孔。細胞培養7d后，細胞樣品加入預冷的Trizol,提取總RNA后檢測其純度,根據RNA逆轉錄試劑說明書逆轉錄合成cDNA。將合成后樣品進行實時定量PCR(RTPCR)檢測成骨分化相關基因BMP-2、COL-I、OCN、Runx2的表達。每組設置3個復孔。反應條件：50℃，2min；95℃，10min；95℃變性15s，60℃退火20s，72℃延伸30s，共40個循環。以管家基因β-actin作為內參，目的基因表達通過2-ΔΔCt進行相對定量。各引物序列見表1。

表1 RT-qPCR檢測的基因引物序列

1.6 BMP-2信號通路抑制劑作用檢測 將MC3T3-E1細胞以1×105細胞/孔密度接種于24孔板，待細胞貼壁后，分別加入Noggin(100ng/ml)及川陳皮素(10μM)，使其分為三組，A：對照組；B：川陳皮素(10μM)組；C：Noggin(100ng/ml)+川陳皮素(10μM)組，每組3個復孔。細胞成骨培養7d后，按照上述實驗步驟將各組樣品進行RT-PCR檢測 BMP-2、COL-I、OCN、Runx2基因表達。

1.7 統計學分析 所有數據均表示為平均值±標準差，使用SPSS 22.0統計分析軟件，用t檢驗和方差分析進行統計學分析。P＜0.05被認為有統計學意義。

2.結果

2.1 川陳皮素對MC3T3-E1細胞增殖的作用CCK-8法測定結果顯示：與0μM濃度組(對照組)相比，川陳皮素處理48h后,10-9、10-8M濃度組MC3T3-E1細胞的增殖活性上升，但與0μM濃度組之間無顯著性差異；10-7,10-6，10-5M濃度組細胞的增殖活性上升，與0μM濃度組之間有統計學差異(P＜0.05)(圖1)。根據不同濃度川陳皮素溶液對MC3T3-E1細胞增殖活性的影響，可確定后續實驗川陳皮素的濃度分別為：0.1μM、1μM、10μM。

圖1 川陳皮素對MC3T3-E1細胞增殖的作用

2.2 川陳皮素對MC3T3-E1細胞ALP活性的影響 MC3T3-E1細胞經不同濃度的川陳皮素處理10d后，進行ALP染色可見細胞被染成灰黑色，染色深度且呈藥物濃度依賴性，川陳皮素溶液濃度越高，ALP染色結果越深(圖2A)。ALP活性定量結果與川陳皮素溶液濃度呈遞增效應，結果顯示：川陳皮素處理10d后，0.1μM、1μM、10μM三個實驗組結果與0μM對照組均有統計學差異(P＜0.05)(圖 2B)。

圖2 川陳皮素作用下MC3T3-E1細胞的ALP染色及活性定量檢測

2.3 川陳皮素對成骨標志基因表達的影響 誘導MC3T3-E1成骨分化7天后，RT-qPCR結果顯示，與0μM對照組相比，0.1μM、1μM、10μM濃度的川陳皮素升高了成骨分化相關因子BMP-2、COL-I、Runx2、OCN 的基因表達(P＜ 0.05)(圖 3)。

圖3 川陳皮素對MC3T3-E1細胞成骨基因表達的影響

2.4 Noggin部分抑制了成骨標志基因的表達為研究川陳皮素是否通過BMP-2途徑促進MC3T3-E1成骨分化，使用BMP-2信號抑制劑Noggin預處理細胞2 h，再檢測川陳皮素對成骨基因表達的影響。根據ALP及成骨標志性基因檢測結果，本部分實驗采用了10μM川陳皮素作為藥物處理對照組。結果發現，川陳皮素+Noggin組處理后，BMP-2、COL-I、Runx2、OCN基因的表達水平降低，與川陳皮素10μM處理組之間存在統計學差異(P＜0.05)(圖4)，且成骨基因的表達水平均高于0μM對照組，并且與0μM組之間存在統計學差異(P＜ 0.05)(圖 4)。

圖4 川陳皮素及BMP-2通路抑制劑作用后成骨基因的表達

3.討論

成骨細胞來源于骨髓間充質干細胞，在骨形成過程中，隨著細胞外基質的不斷分泌、礦化，最終成熟為骨細胞。因此，研究如何促進成骨細胞的分化及功能對于骨再生修復有著重要的臨床意義。目前，一些蛋白類生長因子，如骨形成蛋白，確實在骨修復中被證實具有促進骨組織再生的優勢。然而，由于該類生長因子的成本和存儲要求均較高，使得其在骨再生修復中的廣泛應用受到限制。近年來的研究發現，傳統中藥能夠通過影響成骨細胞功能，促進成骨細胞分化，實現骨組織再生[2]。

本研究中，川陳皮素促進了MC3T3-E1細胞的增殖，升高了成骨分化標志物ALP的活性，并激活了成骨關鍵因子Runx2、COL-I及OCN的基因表達。Runx2是骨形成早期最重要的核心轉錄因子，Runx2不僅能被多種細胞因子、激素、力學刺激等因素所調控，還能夠激活下游細胞外基質蛋白如OCN、COL-I的轉錄和表達[7-9]。我們的研究結果表明，川陳皮素促進了成骨前體細胞MC3T3-E1的成骨分化。川陳皮素屬于母核結構為2-苯基色原酮的黃酮類化合物，諸多研究表明，黃酮類化合物如淫羊藿苷、槲皮素、金雀異黃酮等均能調節Runx2的表達，促進成骨細胞的增值與分化[10,11]。我們推測，由于化合物的生理活性與其化學結構特征密切相關，川陳皮素具有的黃酮母核結構以及羥基化模式可能是其促進成骨細胞增殖與分化的重要原因。

BMP家族信號分子能調控成骨細胞的分化及骨形成，作為BMP家族的重要成分之一，BMP-2在細胞及動物學實驗中均證實有較強的促成骨作用[12]。BMP-2信號經配體與細胞膜表面的BMP受體結合，再激活BMP信號通路特異性調節蛋白Smad1/5/8磷酸化，Smad1/5/8與Smad4結合后，進入細胞核內，通過識別Runx2基因啟動子區域，激活Runx2，從而促進基質分泌及骨形成[13]。本研究發現，川陳皮素能激活BMP-2基因表達，應用BMP-2通路阻斷劑Noggin，發現Noggin能明顯抑制川陳皮素激活的成骨標志性基因的表達下降。我們推測，BMP-2信號可能參與了川陳皮素調控MC3T3-E1成骨分化的過程。在成骨分化過程中，各種成骨信號通路與成骨信號因子彼此相互聯系、相互影響，協同調節細胞的增殖與成骨分化。在本實驗中，BMP-2、Runx2、OCN、COL-I基因水平較未加阻斷劑時有顯著下降，但仍高于0μM組水平，說明川陳皮素可能同時激活了其他成骨相關信號通路。

有研究表明，川陳皮素能通過MAPK信號通路，抑制轉錄因子NF-kB與AP-1活性，抑制破骨細胞成熟，降低骨質疏松及骨關節炎小鼠的骨吸收[5]。Tsukasa等的研究發現，川陳皮素能抑制脂多糖誘導的破骨細胞炎癥反應，降低實驗性牙周炎引起的牙槽骨骨吸收[6]。以往的研究表明川陳皮素能明顯抑制破骨細胞功能，對炎癥及雌激素缺乏引起的骨量丟失有明顯抑制作用。本研究發現，川陳皮素能促進成骨細胞分化，結合以往的研究，我們推測，川陳皮素可能通過促進骨形成及抑制骨吸收的雙重作用調控骨改建過程，實現骨組織再生修復，相關研究仍有待深入探討。