參芪蛭龍湯對膜性腎病大鼠血清中IL-2、IL-6和TNF-α水平的影響

薛丕良，李鳳金，白茹，劉欣欣，袁茵，肖洪彬，牛雯穎*

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省中醫藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150036)

膜性腎病是血清特異性抗體與足細胞表達的自身抗原結合引發的自身免疫性疾病，上皮下出現免疫復合物沉積和補體激活導致腎小球濾過屏障功能障礙和蛋白尿形成。胸腺和脾臟是人體重要的免疫器官，白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是胸腺基質細胞分泌的細胞因子，這些細胞因子通過與胸腺細胞表面相應受體結合，調節胸腺細胞的發育，促進T細胞的分化成熟。本實驗主要觀察大鼠血清中IL-2、IL-6、TNF-α的表達水平以及胸腺和脾臟指數。探討參芪蛭龍湯的作用機制及IL-2、IL-6和TNF-α與膜性腎病發病的關系。

1 材料

1.1 主要儀器

全自動酶標儀(美國Bio-Rad公司，型號：iMarkTM)；日立透射電子顯微鏡(上海鑄金分析儀器有限公司，型號：H-7650)。

1.2 藥物及試劑

參芪蛭龍湯(組方:黨參、黃芪、當歸、川芎、水蛭、地龍、僵蠶、虎杖、淫羊藿和鳳尾草，中藥飲片購于黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院)；大鼠白介素(IL-2)檢測試劑盒、白介素(IL-6)檢測試劑盒、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司，批號：20180702)。

1.3 動物

清潔級Wistar大鼠40只，雌雄各半，體質量(228±19)g。由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK(黑)2008-004。

2 方法

2.1 藥物制備

參芪蛭龍湯由黨參20 g，黃芪30 g，當歸15 g，川芎15 g,水蛭5 g(研末沖服),地龍20 g，僵蠶15 g，虎杖15 g，淫羊藿30 g和鳳尾草15 g組成。以上10味，加12倍量水浸泡1 h，煎煮1 h后，濾過。藥渣再加10倍量水煎煮1 h，濾過。合并2次濾液，60℃濃縮成1∶1的藥液，儲存備用。

2.2 陽離子化牛血清白蛋白(C-BSA)制備

參照Border法[1]，取67 mL無水乙二胺(EDA)液，加入500 mL雙蒸水，再加入6 mol/L鹽酸350 mL，調整pH值到4.75，冷卻至25℃，進行攪絆，再加入天然牛血清白蛋白(N-BSA)5 g溶于25 mL重蒸餾水的溶液，攪拌完全后再加1.8 g炭化二亞胺鹽酸鹽(EDCHCL)維持25℃，持續攪拌2 h，保持pH值4.75，最后加入4 mol/L(pH值4.75)的醋酸緩沖液30 mL，終止反應，即得到等電點提高的C-BSA溶液。將C-BSA溶液置于透析袋中，用4℃的雙蒸水透析72 h(3～5 h換水1次)，冷凍干燥后，即得BSA干粉。用聚丙烯酰胺等測定其等電點(PI)，PI>8.5即可。C-BSA保存于-40℃備用。

2.3 膜性腎病大鼠模型復制

取Wistar大鼠40只，適應性飼養1周后，將大鼠置于代謝籠中，接24 h尿液，測尿蛋白含量。

預免疫：對尿蛋白陰性的大鼠，留出10只作空白對照，對其余大鼠進行預免疫。將80 mg C-BSA溶于15 mL PBS中，與等量弗氏不完全佐劑混合，超聲乳化完全后進行預免疫。除空白對照組外，于每只大鼠腹股溝、腋窩等處進行多點皮下注射，每只0.3 mL 的乳化物，每點注射不超過0.05 mL。正常對照組則以PBS與弗氏不完全佐劑按上述比例乳化后進行皮下注射。1周后，進行正式免疫(制作模型)：每次將C-BSA溶于1 mL PBS中進行尾靜脈注射，首次C-BSA尾靜脈注射量為3.5 mg/只，隔日1次，每周3次，6周內緩慢將注射量遞增至5 mg/只，正常對照組注射同體積的PBS。6周后留取動物24 h尿液，測尿蛋白含量。

2.4 分組給藥

將造模成功的30只大鼠按照尿蛋白數值隨機分為參芪蛭龍湯低劑量組、高劑量組和模型組，每組10只。參芪蛭龍湯組灌胃給藥劑量為4 g生藥/kg和8 g生藥/kg?？瞻捉M和模型組大鼠灌胃給予等體積的蒸餾水。在造模2周后開始給予中藥湯劑早晚各1次，連續給藥4周。

2.5 檢測指標

2.5.1 血清中IL-2、IL-6、TNF-α的水平

采用IL-2、IL-6、TNF-α測試盒，用雙抗夾心酶聯免疫吸附(ELISA)方法檢測大鼠血清中IL-2、IL-6、TNF-α的水平。

2.5.2 胸腺和脾臟指數

稱大鼠體質量后，采用5%水合氯醛腹腔注射麻醉，取大鼠胸腺和脾臟，稱內臟重量；計算出臟器指數(內臟)。

臟器指數(%)= 脾臟或胸腺質量(mg)/大鼠體質量(g)×100%

2.5.3 電鏡觀察大鼠腎組織病理形態

電鏡標本(取1 mm×1 mm×1 mm大小腎皮質)采用2.5%戊二醛固定液固定，乙醇梯度脫水，環氧樹脂包埋切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察。

2.6 統計方法

3 結果

3.1 對膜性腎病大鼠體質量的影響

由表1可見，造模前，各組大鼠間體質量無顯著性差異(P>0.05)。與空白組比較，模型組大鼠給藥后體質量顯著降低(P<0.01),而參芪蛭龍湯組大鼠體質量有升高趨勢，但與模型組比較，無顯著差異性(P>0.05)。

表1 參芪蛭龍湯對膜性腎病大鼠體質量的影響比較

注：與空白組比較，**P<0.01。

3.2 對膜性腎病大鼠胸腺和脾臟重量及指數的影響

由表2可見，與空白組比較，模型組大鼠脾臟重量、脾臟指數和胸腺指數均顯著升高(P<0.01)，而胸腺重量有升高趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)。與模型組比較，參芪蛭龍湯高劑量組可顯著降低膜性腎病大鼠脾臟重量、胸腺指數、脾臟指數(P<0.01,P<0.05)，而對胸腺重量有降低趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)。

3.3 對膜性腎病大鼠血清IL-2、IL-6和TNF-α含量的影響

由表3可見，與空白組比較，模型組大鼠血清中IL-2含量顯著降低(P<0.01)；TNF-α含量顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，參芪蛭龍湯低劑量和高劑量組IL-2含量均顯著升高(P<0.05或P<0.01)；參芪蛭龍湯低劑量組TNF-α含量呈下降趨勢(P>0.05)，參芪蛭龍湯高劑量組TNF-α含量顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，空白組、參芪蛭龍湯低劑量組和高劑量組中IL-6含量均無顯著性變化(P>0.05)。

表2 參芪蛭龍湯對膜性腎病大鼠胸腺和脾臟重量和指數影響的比較

注：與模型組比較,**P<0.01，*P<0.05;與空白組比較，#P<0.01。

表3 參芪蛭龍湯對膜性腎病大鼠血清中IL-2、IL-6和TNF-α含量影響的比較

注：與空白組比較,#P<0.01，△P<0.05;與模型組比較，**P<0.01,*P<0.05。

3.4 對膜性腎病大鼠腎臟病理變化的影響

由圖1所示，空白組大鼠腎臟組織中腎小球足細胞結構清晰、足突無融合、基底膜均勻、無增厚、上皮下無電子致密物形成。模型組大鼠腎臟組織中腎小球足突廣泛融合或消失、微絨毛形成、基底膜彌漫重度增厚、上皮下大量大塊電子致密物沉積，電子致密物周圍大量基底膜增生。參芪蛭龍湯低劑量組腎臟組織中腎小球足突廣泛融合、基底膜彌漫輕度增厚，少量電子致密物沉積。參芪蛭龍湯高劑量組足突彌漫融合，基底膜僅部分增厚，極少電子致密物沉積。

圖1 參芪蛭龍湯對膜性腎病大鼠腎組織病理形態的影響(20 000×)

4 討論

參芪蛭龍湯是在廣泛查閱文獻，總結歷代醫家經驗的基礎上，反復遴選，精簡藥味而成，應用臨床多年，療效確切。膜性腎病以脾腎虧虛為本，濕濁瘀血為標。方中黨參、黃芪補益脾氣,淫羊藿補益腎陽、鼓舞腎氣，為君藥；當歸、川芎活血化瘀，水蛭、地龍、僵蠶蟲類入絡，化瘀消癥為臣藥；虎杖、鳳尾草活血化瘀、利水消腫為佐藥；全方共奏補益脾腎、化瘀利濕之效。黃芪具有降低血液高黏度狀態，控制炎癥反應，增強機體免疫功能[1]。水蛭中含有水蛭素、肝素和抗血栓素成分，具有抗凝、降低血液黏稠度等作用，可改善腎病綜合征高脂高凝狀態[2]。當歸可以降低血小板聚集、降低血脂，保護肝臟、利尿、抗炎、抗氧化和清除自由基、抗組織纖維化、改善腎臟組織的血流灌注從而減輕腎組織的缺氧性損傷[3-4]。黨參能調節機體的細胞免疫和體液免疫功能，使巨噬細胞數量增加，提高網狀內皮細胞吞噬能力[5]?；⒄溶湛赏ㄟ^抑制腎組織中Toll樣受體4(TLR4)、髓樣分化因子(Myd88)、核轉錄因子KappaB(NF-КB)的表達，抑制其下游通路炎癥因子IL-6，TNF-α的生成，減少炎癥因子對腎組織的攻擊損害[6]。

特發性膜性腎病病理特點是電鏡下腎小球基底膜彌漫性增厚，上皮下電子致密物沉積。這些沉積于上皮下的免疫復合物來源于循環中自身抗體與表達于足細胞上的內源性抗原的結合[7]，上皮下免疫復合物沉積和補體激活導致腎小球濾過屏障功能障礙和蛋白尿形成。細胞因子是由免疫原、絲裂原或其他因子刺激細胞所產生的低分子量可溶性蛋白質，具有調節固有免疫和適應性免疫應答的作用。IL-2具有活化T細胞并促進其增殖的作用，IL-6可促進B細胞的活化、增殖和分化為抗體產生細胞，TNF-α通過促使炎癥細胞因子的合成與釋放,促進細胞黏附分子的表達、以及促進前列腺素E2血小板活化因子的合成與釋放,使炎癥細胞聚集與黏附、微血管擴張與通透性增加[8]。TNF-α多由T細胞與單核/巨噬細胞產生，在腎臟疾病發病中發揮著重要作用的炎癥介質，一方面可對組織細胞直接作用，另一方面也會誘發其他類型的炎癥介質間接地發揮作用[9]。

本研究中發現，與正常組大鼠比較，膜性腎病大鼠血清中IL-2含量顯著下降。參芪蛭龍湯治療后血清中IL-2含量顯著升高(P<0.05)。實驗研究膜性腎病大鼠血清IL-2水平降低，可能與該病免疫力低下有關。IL-6是參與免疫調節和炎癥反應的重要細胞因子，正常腎臟細胞產生微量的IL-6，當腎小球細胞或系膜受到TNF-α刺激后，IL-6分泌可增加，IL-6與細胞膜上的受體結合刺激腎小球系膜細胞增殖。因而TNF-α和IL-6與增殖性腎小球疾病的發生、發展密切相關[9]。本研究中模型組TNF-α水平顯著升高，與空白組相比有統計學差異(P<0.05)。經參芪蛭龍湯治療后，與模型組比較，中藥高劑量組TNF-α水平明顯下降(P<0.05)，中藥低劑量組TNF-α水平呈下降趨勢，但無統計學差異(P>0.05)。空白組、模型組、中藥高低劑量組IL-6水平均無顯著差異。結合其他的研究成果發現,PNS可能與炎癥因子 TNF-α、IL-6 升高有關[10-11]。

腎病綜合征根據病理類型分為微小病變腎病、系膜增生性腎炎、局灶節段性腎小球硬化、膜型腎病和系膜毛細血管性腎小球腎炎。以往對IL-2、IL-6、TNF-α等細胞因子在腎病綜合征發病中作用的實驗研究均未明確進行病理分型，所以出現不同的實驗結果，甚至有些實驗結果完全相反。本實驗研究針對膜性腎病大鼠進行研究發現，膜性腎病大鼠IL-2水平下降、TNF-α水平升高，IL-6水平未見明顯變化，提示不同病理類型的腎病綜合征，其發病參與的炎癥因子不同，IL-6未參與膜性腎病的發病。有實驗研究表明,IL-6作為腎臟系膜細胞的一種自分泌生長因子,能夠促進腎臟系膜細胞增多和基質增生，且與之呈正相關[12]。膜性腎病系膜細胞和基質均正常，也說明IL-6未參與膜性腎病的發病。系膜增生性腎炎、局灶節段性腎小球硬化、系膜毛細血管性腎小球腎炎系膜細胞和基質均有不同增生，結合以往實驗研究發現，IL-6可能參與系膜增生性腎炎、局灶節段性腎小球硬化、系膜毛細血管性腎小球腎炎的發病。Horii等[13]研究表明，微小病變腎病(MCNS)和正常人尿中無IL-6活性，可能IL-6未參與微小病變型腎病的發病。

本次實驗研究表明,參芪蛭龍湯能升高膜性腎病大鼠血清IL-2水平，降低TNF-α水平，提示IL-2和TNF-α可能參與大鼠膜性腎病的發病，IL-6與大鼠膜性腎病發病無關。膜性腎病胸腺和脾臟指數增大，提示存在異常免疫功能亢進。