茜草總蒽醌對環磷酰胺誘導小鼠白細胞降低的保護作用及其作用機制

張振巍，崔璀，張娜娜

(1.中國人民解放軍第一五五中心醫院，河南 開封 475003； 2.河南應用技術職業學院，河南 開封 475000； 3.開封市中醫院，河南 開封 475000)

白細胞減少在臨床放、化療中較為常見，治療中多采用粒細胞集落刺激因子類藥物，但該類藥物價格昂貴，不良反應較大，可引起骨痛、發熱、白細胞減少等不良反應，有些藥物還可能刺激某些惡性腫瘤的生長。因此，尋找治療白細胞減少癥的低毒高效藥物成為近幾年研究的熱點。植物多糖類大分子成分能激活免疫受體，提高機體免疫能力，并且毒副作用小、安全性高、抑瘤效果好,在臨床研究中得到深入發展。為拓展植物藥在臨床的應用范圍，中藥組分對機體免疫的作用在近幾年研究中逐漸深入，但也有些非多糖類成分對白細胞減少癥有著積極的治療作用，如雞血藤[1]有效部位群(總黃酮類成分)在4.05 g/kg的給藥劑量以上對環磷酰胺(CTX)致白細胞低下的大鼠有較好的升白作用，與空白組比較無統計學意義，說明雞血藤黃酮類成分能有效拮抗免疫抑制大鼠的白細胞減少。六月青皂苷類成分可顯著提高CTX免疫抑制模型小鼠的特異性及非特異性免疫反應，提高其免疫力[2]。前期研究中,課題組發現茜草總蒽醌(TAR)能明顯促進機體免疫、延長免疫抑制小鼠生存時間，基于此，本研究從保護白細胞減少為基礎，探討茜草總蒽醌對環磷酰胺誘導小鼠白細胞降低的保護作用及其可能機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

昆明種小鼠18～22 g，購自河南省動物實驗中心。雌雄各半。實驗動物許可證號:SCXK(豫)2013-0002，普通飼料喂養，自由飲水，溫度控制在19℃～25℃，相對濕度為30%～70%。

1.2 藥品與試劑

環磷酰胺注射液(CTX，江蘇恒瑞藥業有限公司，批號為H32020857)；大鼠抗小鼠CD34+抗體(美國CALTAG公司)；血清粒細胞集落刺激因子(G-CSF，南京建成生物工程公司，批號為0504191)。地榆升白片(成都地奧集團天麻藥業股份有限公司，批號為13080627,0.1 g/片)。茜草總蒽醌(Total Anthraquinone ofRubiaCordifoliaL.,TAR)的制備：取茜草飲片500 g，加入10倍量乙醇，連續回流提取3次，每次1.5 h，減壓回收乙醇，用石油醚萃取，除去醚溶性成分，再將醇濃縮液用氯仿-乙酸乙酯(1:2)萃取2次，合并萃取液，真空干燥即得茜草總蒽醌[3]。

1.3儀器

XSP-C204型生物顯微鏡(重慶光學儀器廠)；AY120電子天平(SHI-MAZDU公司)。

2 方法

2.1 動物分組及模型制備

取小鼠50只，隨機分為5組，每組10只，分別為正常組、模型組、地榆升白組(簡稱陽性組，臨用前研成細粉，用生理鹽水配制成濃度為0.1 g/15 mL的混懸液，實驗給予100 mg/kg劑量)和茜草總蒽醌高、低劑量組(簡稱高、低劑量組，用量分別為120 mg/kg、60 mg/kg)，除正常組外其余各組小鼠均腹腔注射等劑量的環磷酰胺100 mg/kg，連續3天，每天1次，復制白細胞減少動物模型[4-5]。

2.2 外周血WBC測定

小鼠末次給藥后30 min，眼眶靜脈叢取血，按照常規方法在低倍顯微鏡下計數。

2.3 BMC測定

小鼠脫臼處死，分離并取出右側股骨中斷7 mm，用3%乙酸溶液沖出骨髓細胞，在血細胞計數盤上計數四個大方格的細胞數，然后乘以2.5×104，即得1根股骨中骨髓有核細胞總數[6-7]。

2.4 CD34+細胞檢測

參照文獻[1]方法檢測：用含牛血清白蛋白濃度為0.2 %的磷酸鹽緩沖溶液沖出小鼠左側股骨骨髓細胞，取1×106個細胞加入30 μL正常小鼠血清以封閉非特異結合位點，加入10 μL FITC標記的CD34+抗體，對照管中加入相應的對照抗體，4℃避光反應30 min，加入2 mL紅細胞裂解液，反應5 min后，沖洗2次，加入濃度為3 μg/mL的碘化丙啶染液，采用流式細胞儀進行檢測。

2.5 脾臟指數和胸腺指數檢測

小鼠處死后，取出各組小鼠的脾臟和胸腺，分別稱重后計算臟器指數。

臟器指數=臟器重量/體質量

2.6 脾集落形成單位(CFU-S)檢測

參照相關文獻[8-9]，各組小鼠脫臼處死后，取出脾臟，去除筋膜，稱重后固定于Bauin染液中，24 h后鏡下觀察、計數。

2.7 血清G-CSF活性測定

將每組小鼠的血液常溫下靜置30 min后，離心15 min，3 500 r/min，取上清液，按照試劑盒說明測定G-CSF活性。

2.8 統計學處理

3 結果

3.1 茜草總蒽醌對CTX致小鼠WBC、BMC細胞及臟器指數的影響

由表1可以看出：模型組的WBC、BMC細胞及臟器指數等指標均低于正常組(P<0.05)，說明CTX對小鼠免疫應答出現抑制狀態，提示模型復制成功。陽性組和茜草總蒽醌的高、低劑量組對CTX致小鼠WBC、BMC細胞及臟器指數均有不同程度改善，與模型組比較均有顯著性差異(P<0.05)；其中高劑量組的TAR對WBC的恢復能力優于BMC，升高免疫抑制小鼠WBC數量與正常組相當，稍低于正常組，統計學對比顯示沒有顯著性差異(P>0.05)；TAR高、低劑量組能顯著對抗CTX致小鼠免疫器官萎縮的癥狀，即提高免疫抑制小鼠免疫器官指數，且高劑量組明顯優于低劑量組治療效果(P<0.05)，說明茜草總蒽醌對抗CTX致小鼠白細胞降低呈現劑量依賴作用；提示TAR對免疫器官有較好的保護作用，并能積極恢復CTX致小鼠的免疫抑制狀態。

表1 各組對CTX致小鼠WBC、BMC細胞及臟器指數影響

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，◇P<0.05。

3.2 茜草總蒽醌對CTX致小鼠CD34+、CFU-S、血清G-CSF的影響

正常狀態下機體造血主要由骨髓承擔，脾臟只是肩負造血的儲備功能，因此脾臟指數、CFU-S指標并不高，模型組的CFU-S指標較正常組明顯下降(P<0.05)，說明小鼠造血組織大量破壞、萎縮，這與脾臟指數降低相一致。CD34+抗原陽性率反映出小鼠造血干/祖細胞數量的變化，由表2可以看出：陽性組和TAR高、低劑量組均能大幅度的提升CD34+抗原陽性率，高劑量的TAR對其提升水平甚至高于正常組，與正常組比較有顯著性差異(P<0.05)，提示TAR高劑量時能迅速恢復小鼠體內造血干細胞的造血功能，使造血干/祖細胞數量增加；此調控作用與G-CSF響應相一致，從多角度反應了TAR對CTX致小鼠白細胞降低的保護作用可能與其能快速恢復造血干/祖細胞數量，增加CD34+、CFU-S、血清G-CSF指標有關。

表2 各組對CTX致小鼠CD34+、CFU-S、血清G-CSF指標影響

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，◇P<0.05。

4 討論

CTX是一種細胞周期非特異性廣譜抗腫瘤藥物和免疫抑制劑，其殺傷腫瘤細胞的同時也可對正常組織細胞造成傷害，如淋巴細胞、造血干細胞等，從而造成免疫功能及造血功能低下。本實驗中，小鼠連續腹腔注射3天100 mg/kg，小鼠白細胞數、骨髓有核細胞數、免疫器官質量均明顯低于正常組(P<0.05)，說明模型復制成功。地榆升白片是中成藥制劑，君藥是地榆，從其化學成分的角度來看，主要含有皂苷、鞣質、黃酮類成分，具有止血、抗菌消炎、促進傷口愈合等作用。研究表明該制劑能顯著改善骨髓微循環的造血環境，促進骨髓造血干細胞增殖及分化，并能顯著改善免疫抑制小鼠的外周血白細胞數量[10]，因此實驗中選擇該成藥作為陽性對照藥物進行實驗。

CD34+是20世紀80年代中期由美國科學家發現的一種細胞表面分子，其在正常骨髓單個核細胞中約占1%～4%，因此CD34+是造血干細胞特異性的表面標記物，在臨床上，通常采用流式細胞儀對CD34+造血干細胞計數以評估骨髓動員效果[11]。CD34+抗原選擇性表達于小鼠早期造血干/祖細胞膜表面，并隨細胞分化成熟而減少至消失，是小鼠造血干/祖細胞的表面標志，其數量的變化能反映出小鼠造血干/祖細胞的數量；從實驗結果來看，模型組CD34+細胞與正常組比較陽性百分率大幅度下降(P<0.05)，說明模型復制成功；高、低劑量的茜草總蒽醌有不同程度的升高CD34+細胞的作用，高劑量的TAR組陽性率較正常組高，提示TAR能增加造血細胞的分化，促進細胞因子分化、成熟[12]。G-CSF是正常造血細胞的增殖分化過程中一種重要的造血正性調控因子，能促進骨髓粒系、單核細胞系、巨噬細胞系發育和成熟，增加外周血成熟粒細胞、單核巨噬細胞功能的一種細胞因子[13-14]；數據顯示，陽性組和TAR高、低劑量組均能不同程度的提升G-CSF水平，且TAR高劑量組與陽性組作用強度相當，與模型組比較有統計學意義(P<0.05)；提示TAR能促進造血調控因子的分化，對造血細胞的功能恢復有積極促進作用，提升免疫抑制小鼠的免疫能力，對抗CTX誘導的免疫抑制，這可能是TAR升高白細胞、促進骨髓造血系統恢復的機制之一。

外周血白細胞計數是腫瘤化療過程中常規檢查指標之一，反映了放療、化療對骨髓的抑制程度和機體免疫狀態；實驗結果顯示，模型組的WBC計數較正常組低，并有統計學意義(P<0.05)，說明模型復制成功。陽性組和高、低劑量的TAR能明顯對抗CTX致小鼠白細胞的降低(P<0.05)，TAR的對抗作用呈現劑量依賴關系。骨髓有核細胞(BMC)包含了粒系、紅系、巨核系的祖細胞，其計數在一定程度上反映了骨髓造血細胞的增生情況，實驗表明，TAR能升高CTX致小鼠的BMC降低，說明TAR可能通過刺激骨髓造血功能增加血液白細胞數量[15]。脾臟、胸腺是機體重要的免疫器官，同時脾臟還有一定的造血功能，當骨髓功能受損時，脾臟可代償性髓外造血。實驗結果表明，TAR高、低劑量組可明顯拮抗CTX導致的小鼠免疫器官質量降低(P<0.05)，提示TAR能促進骨髓造血，對模型小鼠的免疫器官能起到有一定的保護作用。CFU-S是脾臟造血干細胞在脾臟表明產生細小的顆粒狀突擊，即為脾結節；實驗結果顯示TAR高、低劑量組對造血干/祖細胞的數量和增殖能力有保護作用，這與WBC和BMC檢測結果相一致。

綜上所述，茜草總蒽醌(TAR)可顯著對抗環磷酰胺誘導的小鼠白細胞降低作用，其作用機制可能與TAR誘導刺激骨髓造血功能恢復，引導造血調控因子分化，增加血液白細胞數量有關；同時TAR還能刺激機體的免疫器官，促進脾臟造血干細胞脾結節的產生，進而機體自身抵抗力，發揮對白細胞的保護作用。