蘿卜硫素對人胃癌細胞HGC27的抑制作用及其機制研究

馮莉芳，涂毅，張玲莉

(1.武漢大學人民醫院感染管理辦公室； 2.武漢大學人民醫院藥學部,湖北 武漢 430060)

臨床調查發現人們經常吃蔬菜和水果患消化道癌癥的幾率較低，其原因可能是由于蔬菜和水果中存在一種或多種抑制腫瘤發展的植物活性物質。蘿卜硫素(sulforaphane，SFN)是一種具較強抗癌作用的植物活性成分，主要在西蘭花、花椰菜及甘藍菜等蔬菜中含量較高[1]。研究發現蘿卜硫素是一種多功能酶誘導物，能夠誘導Ⅱ型解毒酶的產生，從而發揮抗癌的效果[2-4]。胃癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，在腫瘤發病率中穩居第4位，而在我國每年新增患者占全球的40%。由于對胃癌的早期診斷率較低，而且胃癌是一種多因素、發病機制復雜的腫瘤，目前對其發病機制的研究還不能解釋很多問題，所以在胃癌診斷和治療的研究中還存在較大空間[5-7]。目前，較多的研究報道蘿卜硫素可以預防、延緩或逆轉腫瘤出現前的病變，能夠對多種腫瘤具有較好的預防作用，是一種頗有價值的抗腫瘤活性成分[8]。前期也研究證實了蘿卜硫素對氧化應激引起的胃黏膜損傷具有保護和修復作用，并且還能對胃黏膜的炎性反應起到抑制效果[9]。本文研究蘿卜硫素對人胃癌細胞HGC27的抑制作用及其可能的作用機制，以期為蘿卜硫素的臨床應用提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

HGC27人胃癌細胞株(武漢巴菲爾生物有限公司)；蘿卜硫素(上海原葉生物科技有限公司，HPLC檢測質量分數≥99%，批號：CAS:142825-10-3)，采用二甲基亞砜(DMSO)溶解制備成儲存液，使用前稀釋成相應濃度便可；ATP標準品(Sigma公司，批號：CFAD-A3377-1G)；DCFH-DA(Sigma公司，批號：2044-85-1)；CCK8試劑盒(Sigma公司)；DMEM培養基(上海吉諾公司)；胎牛血清(FBS，四季青公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液、SDS-PAGE凝膠試劑盒均購自碧云天生物科技有限公司；抗體Bax、Bcl-2、p53、及β-actin均購自美國Abcam公司。

高效液相色譜儀LC-20AD型(日本島津公司)；Victor3 1420 Multilable Counter酶標儀(DX540，美國)；F2500熒光分光光度計(日本日立公司)；單人超凈臺(蘇州華新空調凈化有限公司)；細胞培養箱(上海醫用分析儀器廠)；SDS-PAGE凝膠電泳(型號DYCZ-24DN，北京六一儀器廠)；成像系統(BIO-RAD，美國)。

1.2 HGC27細胞培養

將HGC27細胞常規接種于含10%FBS、1%雙抗(100 U/mL青霉素-100 μg/mL鏈霉素)的DMEM培養基中，置于37 ℃、5%CO2濃度的培養箱中培養。待細胞生長至90%左右時進行傳代培養。

1.3 CCK8法檢測細胞存活率

將對數生長期的HGC27細胞消化、重懸、計數后以1×104/孔細胞數接種于96孔板中，每孔終體積為200 μL，每組設置6個平行孔。培養過夜待細胞貼壁后，棄去原培養基，加入200 μL不同濃度的蘿卜硫素培養液(20、40、80 μg/mL)，培養24、48、72 h后，吸去舊培養基，向各孔加入10 μL CCK8試劑，37 ℃、5%CO2濃度的培養箱中繼續孵育1 h，酶標儀450 nm波長處測定各孔吸光度值(A值)，計算細胞存活率SR。SR=實驗組A值/對照組A值×100%。

1.4 DCFH-DA法檢測細胞內ROS活性

HGC27細胞經不同濃度蘿卜硫素干預處理24 h后，將細胞消化并收集于1.5 mL Ep管中，1 500 r/min離心5 min，倒掉上清，向細胞沉淀中加入1 mL DCFH-DA溶液，吹打混勻后37 ℃孵育30 min，再加入PBS終止反應。接著1 500 r/min離心5 min，倒掉上清，收集細胞沉淀，并加入PBS重懸細胞，用F2500熒光分光光度計測定熒光值。其中激發波長設置為488 nm，發射波長設置為525 nm。

1.5 HPLC測定細胞內ATP水平

HGC27細胞經不同濃度蘿卜硫素干預處理24 h后，消化、離心，收集細胞，向細胞中加入0.4 mol/L的高氯酸0.5 mL，吹打混勻后置于-80 ℃冰箱中儲存。待檢測前取出細胞置于冰上解凍，4 ℃、13 000 r/min離心10 min，取20 μL上清進樣分析。色譜條件為：日本島津公司ODS-SP C18(4.6 mm×250 mm，粒徑5 μm)色譜柱，流動相為50 mmol/L磷酸鹽緩沖液-甲醇(95∶5)，柱溫30 ℃，流速0.5 ml/min，檢測波長為254 nm。

1.6 蛋白濃度測定

ROS活性及ATP含量檢測中所設計的蛋白濃度檢測均用BCA試劑盒，其操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.7 Western blot檢測Bax、Bcl-2及p53蛋白的表達水平

HGC27細胞經不同濃度蘿卜硫素干預處理24 h后，消化、離心，收集細胞，加入RIPA裂解液在冰上充分裂解細胞，4 ℃、12 000 r/min離心12 min，提取各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每孔上樣量為30 μg，采用15%的SDS-PAGE凝膠分離蛋白，70 V電泳；在冰水浴中275 mA恒流條件下轉膜。5%脫脂奶粉常溫下封閉1 h，4 ℃條件下孵育一抗過夜，TBST漂洗3次后室溫下孵育二抗，再TBST清洗3次后，在ECL試劑中顯色，Bio-Rad發光系統成像。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 蘿卜硫素對HGC27細胞存活率的影響

HGC27細胞經不同濃度蘿卜硫素干預處理24、48、72 h后，各劑量組細胞存活率顯著低于溶劑對照組(P<0.05)，并且與蘿卜硫素劑量間存在一定的濃度依賴性。在同一劑量的蘿卜硫素干預下，隨著藥物干預處理的時間延長，細胞存活率也呈現出降低的趨勢。見表1。

表1 蘿卜硫素對HGC27細胞存活率的影響Table 1 Effect of sulforaphane on the survival rate of HGC27 cells

與溶劑對照組比較：aP<0.05； 與20 μg/mL蘿卜硫素組比較：bP<0.05； 與40 μg/mL蘿卜硫素組比較：cP<0.05。

2.2 蘿卜硫素對HGC27細胞ROS活性及ATP含量的影響

HGC27細胞經不同濃度蘿卜硫素干預處理24 h后，細胞內ROS水平顯著降低(P<0.05)，ATP含量也顯著降低(P<0.05)，并且均表現出濃度依賴性。見表2。

2.3 蘿卜硫素對HGC27細胞中Bax、Bcl-2及p53蛋白表達的影響

HGC27細胞經不同濃度蘿卜硫素干預處理后，促凋亡蛋白Bax和抑癌蛋白P53表達水平均顯著升高(P<0.05)，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平則顯著降低(P<0.05)，均表現出劑量依賴性。見圖1。

表2 蘿卜硫素對HGC27細胞ROS活性及ATP含量的影響

組別劑量/(μg·mL-1)ROS/(Fluo unit·mg-1)ATP/(μg·mg-1)溶劑對照組03 853±19713.98±1.52蘿卜硫素 低劑量組203 250±164a10.22±1.13a 中劑量組402 658±133ab8.67±0.85ab 高劑量組801 845±115abc6.94±0.65abc

與溶劑對照組比較：aP<0.05； 與20 μg/mL蘿卜硫素組比較：bP<0.05； 與40 μg/mL蘿卜硫素組比較：cP<0.05。

1234abcabaabcabcababaaBax/β-actinBcl-2/β-actinp53/β-actinBaxp53Bcl-2β-actin0.80.60.40.20.00.60.40.20.00.80.60.40.20.01234

1.溶劑對照組； 2. 20 μg/mL蘿卜硫素組； 3. 40 μg/mL蘿卜硫素組； 4. 80 μg/mL蘿卜硫素組。與溶劑對照組比較：aP<0.05； 與20 μg/mL蘿卜硫素組比較：bP<0.05； 與40 μg/mL蘿卜硫素組比較：cP<0.05。

圖1蘿卜硫素對HGC27細胞中Bax、Bcl-2及p53蛋白表達的影響

Figure1Effect of sulforaphane on the expression of Bax,Bcl-2 and p53 proteins in HGC27 cells

3 討論

用不同濃度蘿卜硫素對人胃癌細胞HGC27進行干預處理后，采用CCK8方法對細胞的相對存活率進行檢測發現，蘿卜硫素能夠有效抑制HGC27細胞的生長增殖，并且表現出一定的時間-劑量依賴關系。腫瘤細胞表現出的一個重要特征是生長速度極快，使得惡變組織在短期內體積增長較快，而此時血管形成相對較慢，導致局部缺血缺氧微環境的形成。腫瘤細胞的缺血缺氧會導致線粒體產生較多的活性氧自由基(ROS)，會引發氧化應激損傷[10]。過量的ROS會導致核DNA的損傷、線粒體DNA的突變、蛋白質及脂質的過氧化[11]。除此之外，ROS還可以介導腫瘤細胞生長信號通路的傳導，在腫瘤的發生與發展過程中起著重要的調控作用[12]。本文研究發現蘿卜硫素可以有效抑制HGC27細胞內ROS的水平。另外，腫瘤細胞與正常細胞的主要區別在于前者代謝產生的ATP來自于糖酵解過程[13]。前期也有研究發現3-溴代丙酮酸(3-BrPA)能夠通過抑制癌細胞中ATP的合成，進一步引發腫瘤細胞的死亡[14]。本研究也表明蘿卜硫素可以顯著抑制HGC27細胞內ATP的生成，可能是蘿卜硫素抑制腫瘤細胞增殖的主要原因之一。

Bax是Bcl-2家族中重要的促凋亡蛋白，其作用機制主要是與Bcl-2形成異源二聚體達到抑制Bcl-2的抗凋亡作用，還可以自身形成同源二聚體促使癌細胞凋亡[15]?；罨腂ax可以誘導線粒體釋放細胞色素C，進一步引發細胞凋亡[16]。并且前期研究發現Bax的表達水平與人胃的病變嚴重程度呈負相關性，提示Bax表達的增加可以促使腫瘤細胞凋亡[15]。本研究也發現蘿卜硫素能夠明顯誘導促凋亡蛋白Bax的表達，而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。p53是一種抑癌基因而分布在各種組織細胞中，在DNA損傷的應答反應中，損傷因子通過誘導p53來抑制細胞周期，已達到修復DNA損傷的作用[17]。一旦DNA遭受到無法恢復的損傷，細胞將會進入程序化死亡途徑[18]。本研究亦發現蘿卜硫素可以通過誘導p53的表達來促使HGC27細胞凋亡的發生。

綜上，蘿卜硫素可以有效抑制HGC27細胞增殖，其作用機制可能與調控氧化應激水平、抑制ATP生成、上調Bax、p53及下調Bcl-2蛋白表達水平有關。