1BL/ 1RS易位系HMW-GS組成與品質分析

李亞青，張 楠，張士昌，何明琦，李孟軍

(石家莊市農林科學研究院/河北省小麥工程技術研究中心，河北石家莊 050041)

1BL/1RS易位系是由黑麥的1RS染色體短臂取代普通小麥的1BS染色體短臂形成的，1BL/1RS易位廣泛存在于世界各地的小麥基因組中，在我國小麥育種和生產中也占有重要的地位[1-3]。黑麥1RS染色體短臂替代小麥1BS 染色體短臂給小麥帶來抗逆性、豐產性和穩產性的同時，也導致其烘烤加工品質變差，主要表現為面團粘性增加、面筋強度減弱、面團形成時間顯著變短、最大抗延阻力降低、面團延伸性增加和面包體積減小等[4-5]。1BL/1RS易位使 1BS上編碼低分子量麥谷蛋白亞基的位點Glu-3和編碼γ-醇溶蛋白、ω-醇溶蛋白的位點Gli-1喪失，導入了1RS 上編碼γ-黑麥堿和ω-黑麥堿的Sec-1位點。Sec-1位點編碼的γ-黑麥堿、ω-黑麥堿不能補償Glu-3、Gli-1編碼的低分子量麥谷蛋白和γ-醇溶蛋白、ω-醇溶蛋白的品質效應，引起麥谷蛋白聚合物結構的改變和數量的減少，給1BL/1RS 易位系的SDS 沉降值、和面時間、面團延伸性、耐揉性和抗延阻力等加工品質性狀帶來顯著負面效應[4,6-7]。Sec-1位點編碼的ω-黑麥堿高度親水，致使面團的吸水性增大，持水性降低，面團的穩定性和延伸性降低，從而導致1BL/1RS 小麥烘烤和蒸煮品質下降[8-9]。因此，消除ω-黑麥堿的不良影響是解決1BL/1RS易位系小麥面團不良加工品質的重要途徑之一。解決ω-黑麥堿對面團加工品質不良影響途徑主要包括：(1)導入優質HMW-GS。優質HMW-GS的導入可在一定程度上彌補由ω-黑麥堿基因造成的不良影響[10]。(2) 用1BS上含有Glu-3位點和Gli-1位點的區段置換1RS上含有Sec-1位點的區段。這種策略周期長、花費大，被置換的黑麥的染色體區段可能包括一些對其他性狀有益的基因。(3) 利用轉基因技術沉默ω-黑麥堿基因家族。ω-黑麥堿基因沉默的轉基因株系的面筋指數、沉降值和面團穩定時間均顯著提高，而其農藝性狀，如株高、穗粒數、千粒重和小區產量均未受到不良影響[11]；這種策略存在轉基因后代沉默性狀是否多代穩定遺傳以及轉基因小麥在育種和生產上無法推廣的問題。(4)利用誘變技術敲除1RS上含有Sec-1位點的區段。本課題組利用A-PAGE技術篩選石麥15重離子束誘變的突變體庫，獲得了ω-黑麥堿缺失突變體株系A94；石麥15的面團穩定時間為1.2～1.4 min，而株系A94的面團穩定時間為3.0～3.2 min。

本研究利用SDS-PAGE技術對300份1BL/1RS小麥易位系材料的HMW-GS組成進行解析，并采用DA7200近紅外成分分析儀對其籽粒主要品質性狀進行測定，以深度挖掘1BL/1RS易位系的育種潛力，明確優質HMW-GS對小麥加工品質的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采用酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(A-PAGE)技術從石家莊市農林科學研究院小麥所馬蘭試驗站和河北省農林科學院小麥資源室保存的1 850份小麥品種(系)中鑒定出1BL/1RS易位系482份。在石家莊市農林科學研究院院部試驗地對482份材料連續進行了4年(2011-2015年)農藝性狀觀察和純系選擇，選取在該地區田間表現良好的300份材料進行HMW-GS組成與品質分析。

1.2 小麥1BL/1RS易位系鑒定

采用A-PAGE技術和分子標記技術對供試材料進行鑒定[12-14]。1RS特異性引物AF1/AF4和1BS特異性引物GluB3見表1。PCR 反應體系(20 μL)：2×Taq PCR StarMix(GenStar)10 μL，引物各1 μL(10 μmol·L-1)，模板基因組DNA 2 μL(50 ng·L-1)，ddH2O 6 μL。 PCR擴增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s,退火 30 s,72 ℃ 2 min/1min，35個循環。Taq Polymerase 為2×Taq PCR StarMix(GenStar)。

1.3 小麥HMW-GS組成和品質分析

每個小麥品種的HMW-GS蛋白提取及其SDS-PAGE分析參照魏 樂、朱金寶和 Morel等[15-17]的方法。每個材料取3粒種子分別磨碎，加入200 μL蛋白提取液(0.062 5 mol·L-1Tris-HCl，pH 6.8，5% 巰基乙醇，2% SDS,20%丙三醇，0.002%溴酚藍)，過夜后沸水浴2 min,12 000 r·min-1離心5 min，取上清備用。電泳采用不連續緩沖系統，分離膠濃度8.7%，濃縮膠濃度4.8%，交聯度均為2.67%；緩沖液:25 mmol·L-1Tis-HCl，192 mmol·L-1甘氨酸，0.1%SDS，pH 8.8；100 V恒壓電泳，溴酚藍移動至凝膠底部，停止電泳，染色過夜(10%冰醋酸，25%乙醇，0.01%考馬斯亮藍R250)。脫色(10%冰醋酸，25%乙醇)至蛋白條帶清晰，照相保存。

表1 1BL/1RS易位系檢測引物Table 1 Primers for identification of 1BL/1RS translocation wheat accessions

亞基命名參照Payne 和Lawrence[18]的命名系統。采用DA7200近紅外成分分析儀對小麥籽粒主要品質進行測定[19-20]。

1.4 數據處理

應用Excel 2013軟件對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 1BL/1RS易位系鑒定

黑麥醇溶蛋白電泳譜上1RS 有1組特征帶，此特征帶為Gli-B1l位點的表達產物[21]，因此小麥醇溶蛋白Gli-B1l可作為1RS/1BL易位系的標記[22]。A-PAGE電泳圖譜顯示，300份小麥材料醇溶蛋白ω區均具有1RS Gli-B1l特征條帶(圖1)。用引物AF1/AF4在300份材料中均可擴增出1 500 bp條帶，用引物GluB3未擴增出相應條帶出現。推測300份材料均具有黑麥1RS染色體，均為1BL/1RS 易位系。

A:醇溶蛋白A-PAGE電泳；B:1RS特異引物AF1/AF4 PCR擴增；C:1BS特異引物GluB3 PCR擴增；M:DNA marker DL2000；1:山農914453；2:河農6049；3:邯早1號；4:邯原1號；5:冀曲麥12；6:萊州3279；7:萊州137；8:石新731；9:金豐4198；10:石麥18；11:石麥15；12:藳優2018；13:師欒02-1；14:ddH2O

A:Gliadins separated on A-PAGE; B:PCR products amplified with 1RS specific primer AF1/AF4; C:PCR products amplified with 1BS specific primer GluB3；M:DNA marker DL2000; 1:Shannong 914453; 2:Henong 6049; 3:Hanzao 1; 4:Hanyuan 1; 5:Jiqumai 12; 6:Laizhou 3279; 7:Laizhou 137; 8:Shixin 731; 9:Jinfeng 4198; 10:Shimai 18; 11:Shimai 15; 12:Gaoyou 2018; 13:Shiluan 02-1; 14:ddH2O

圖11BL/1RS易位系小麥鑒定

Fig.1Identificationof1BL/1RStranslocationwheataccessions

2.2 HMW-GS分析

在300份1BL/1RS易位系中檢出12種HMW-GS類型。Glu-A1位點檢出2種亞基(Null、1)，Null和1亞基出現頻率分別為47.67%和52.33%；Glu-B1位點檢出7種亞基類型(6+8、7、7+8、7+9、13+16、14+15、17+18)，以7+9亞基頻率最高，達到58.67%，優質亞基7+8、14+15和17+18的頻率分別為11.00%、17.00%和9.67%；Glu-D1位點檢出3種亞基類型(2+12、5+10、5+12)，2+12亞基出現的頻率最高，為71.33%；優質亞基5+10和5+12的頻率分別為16.00%和12.67%(表2)。

300份1BL/1RS易位系中檢出27種HMW-GS組合。組合Null/7+9/2+12的頻率最高，為31.67%；其次是組合1/7+9/2+12，頻率為16.00%；組合1/14+15/2+12的頻率為8.67%，其余24種組合出現的頻率均小于5%。從沉降值、烘烤品質和面團強度等方面考慮，在27種HMW-GS組合中有4種優質亞基組合，分別為1/7+8/5+10、1/7+9/5+10、1/14+15/5+10、1/17+18/5+10[23-25]。具有這4種優質亞基組合的1BL/1RS易位系共有31份，出現頻率為10.33%(表3)。300份1BL/1RS易位系的HMW-GS類型豐富，其亞基組合也呈現出較高的多態性。

表2 1BL/1RS易位系 Glu-1位點HMW-GS組成與頻率Table 2 Composition and frequencies of HMW-GS encoded by Glu-1 loci in 1BL/1RS translocation lines

表3 1BL/1RS易位系HMW-GS組合及頻率Table 3 Composition and frequencies of HMW-GS in 1BL/1RS translocation wheat accessions

2.3 品質性狀

300份1BL/1RS易位系的品質性狀呈現出明顯差異。延展性、蛋白質含量、濕面筋含量、硬度和沉降值5項指標的變異系數較大，其中，沉降值變異系數最大，為20.70%；容重的變異系數最小，僅為1.16%(表4)。

表4 1BL/1RS易位系的品質性狀Table 4 Quality performance of 1BL/1RS translocation wheat accessions

小麥烘焙品質與蛋白質含量、濕面筋含量和沉降值正相關[25-26]。進一步結合HMW-GS組成分析，在300份易位系中有9份有較高的品質育種價值(表5)，其HMW-GS組合均為優質亞基組合，其中5份的亞基組合為1/7+8/5+10，4份的亞基組合為1/7+9/5+10。 臨遠3158、寒24和煙農18的蛋白質含量分別為11.82%、11.88%和12.17%，蛋白質含量基本達到弱筋小麥標準。這9份材料為1BL/RS易位系在育種中的應用提供了新的候選親本。

表5 優良1BL/1RS種質資源Table 5 Germplasms of 1BL/1RS translocation wheat accessions with good quality

3 討 論

1BL/1RS的1RS不但具有抗條銹病(Yr9)、葉銹病(Lr26)、稈銹病(Sr31)和白粉病(Pm8)基因[1],而且攜帶提高小麥產量和增強對環境適應性的基因，因此1BL/1RS易位系在小麥抗病、抗逆和產量等方面顯示出獨特的優越性[1-2]。但是，Sec-1位點的引入和Glu-3、Gli-1位點的缺失，導致1BL/1RS易位系加工品質下降[4-7]。近年來，在小麥育種中對品質的重視程度不斷提高，1BL/1RS易位系在小麥育種中的利用受到很大的限制。為了更好利用1BL/1RS易位系，挖掘其育種潛力，有必要對現有的1BL/1RS易位系資源進行深入研究，尋找在小麥品質育種具有應用價值的1BL/1RS易位系。

HMW-GS的組成與小麥面粉的理化性質如彈延性及沉淀值等密切相關[18]。優質HMW-GS組合可以補償1RS上Sec-1表達的ω-黑麥堿造成的小麥加工品質的降低[10]。因此，檢出具有優質亞基組合的1BL/1RS易位系，并進一步分析其品質及其遺傳規律，有助于促進1BL/1RS易位系在小麥品質育種中的應用。普通小麥1AL、1BL 和 1DL 上分別具有Glu-A1、Glu-B1和Glu-D13個編碼 HMW-GS 的基因位點，統稱為Glu-1[18]。亞基1、2*、7+8、7+9、13+16、14+15、17+18和5+10對小麥加工品質有正向效應，屬于優質亞基[23-25]。本研究中，1BL/1RS易位系Glu-A1位點編碼2種HMW-GS，其中優質亞基1占比為52.33%；Glu-B1位點編碼 8種亞基組合，其中4種優質亞基(7+8、13+16、14+15、17+18)總計占比38.34%；Glu-D1位點編碼4種HMW-GS，其中優質亞基5+10占比16.00%。在300份1BL/1RS易位系中，有31份在3個位點上均編碼優質亞基，但其品質呈現明顯差別，其中僅9份表現較好。亞基組成相同的小麥品種品質有較大差異,這說明小麥品質除了與亞基組成有關外,還受亞基含量等其他因素的影響[27]。1BL/RS易位系的品質性狀及其品質育種價值有待更深入研究。

本研究中，300份1BL/1RS易位系容重和吸水率的變異系數較小，而其他5項指標的變異范圍較大。鄭91138、淮麥0606、嘉麥4號、陜農78、濟997884、煙2801、煙0401、邯優1號和滄麥028 有較高的品質育種價值。這些材料Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1位點均編碼優質亞基，同時具有較好的蛋白質品質。