頂花板凳果耐寒性分析及評價指標的篩選

張 雨，賈民隆，曹冬梅，王云山，邢國明

（1.山西農業大學園藝學院，山西太谷030801；2.山西省農業科學院園藝研究所，山西太原030031）

頂花板凳果（Pachysandra terminalis Sieb.et Zucc）為黃楊科（Buxaceae）板凳果屬（Pachysandra Michx.）多年生常綠草本，又稱富貴草、頂蕊三角咪，原產于我國湖北、四川、陜西和甘肅等省區，在日本也有分布[1]。其株高20～30 cm，莖肉質，有分枝，無毛；葉互生，革質，有光澤；穗狀花序頂生，單性同株，花期4—5月；果卵形，果期9—10月。頂花板凳果性喜陰濕的環境，多生于海拔1 350～2 200 m的山谷溝邊或林中陰濕處，耐寒性強，引種到北京的2年生苗不需防寒措施可露地越冬[2-4]。其株型美觀、四季常綠，是一種極具觀賞價值的園林植物。頂花板凳果還有很高的藥用價值[5]。目前，國內外對板凳果的研究報道較少，且大多集中在化學成分和藥用與臨床方面。

本研究以頂花板凳果為材料，分析其在冬季自然低溫脅迫下各生理指標的變化，并通過主成分分析法評價各個測定指標的貢獻率，篩選板凳果抗寒性的重要指標，以期為板凳果抗寒性和耐寒機制提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為頂花板凳果，苗齡2 a，在室溫22～25℃下進行常規盆栽管理，選取大小一致、長勢健壯的植株進行低溫處理。

1.2 試驗處理

2018年2月在山西省農業科學院園藝研究所將選取的植株放出室外進行自然低溫處理，連續脅迫96 h，每日溫度為2～15℃。分別在處理0，48，96 h后取成熟葉片用于各項生理指標的測定。以處理0 h作為對照。每處理3次重復。

1.3 測定項目及方法

丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法[6]測定；SOD活性采用氮藍四唑法[6]測定；葉綠素含量采用丙酮、乙醇、水混合液浸提法[7]測定；相對電導率采用電導儀法[8]測定；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250法[9]測定；Ca2+濃度采用電感耦合等離子質譜（ICP-MS）進行測定。

1.4 數據分析

使用Excel 2007進行數據整理，用SPSS 17.0統計軟件進行數據統計分析，采用單因素方差分析法和Duncan法進行多重比較及差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 低溫處理對板凳果葉片的影響

隨著低溫處理的持續，板凳果葉片受凍癥狀逐漸加重。在低溫處理48 h時，葉片卷曲，背面出現水漬狀，正面呈深綠色；在低溫處理96 h時，葉片更加卷曲，變軟變薄，背面水漬狀情況嚴重，葉色與處理48 h相比差異不大。

2.2 低溫處理對板凳果葉片相對電導率和丙二醛含量的影響

從圖1可以看出，板凳果在低溫處理后，電導率呈上升趨勢。在低溫處理48 h時，電導率比對照高37.72百分占，且顯著高于對照；在低溫處理96 h時，電導率高達86.99%，顯著高于對照。本試驗結果與前人[10-11]研究結果一致，說明隨著低溫脅迫的持續，板凳果細胞膜受到了損傷，導致電解質滲透率升高。

由圖2可知，板凳果在低溫處理后，MDA含量呈現上升趨勢。在處理48 h時，MDA含量比對照高0.023 mmol/g，但與對照差異不顯著；在處理96 h后達到最高，為0.343 mmol/g，是對照的1.6倍，與對照差異顯著。

2.3 低溫處理對板凳果葉片SOD活性的影響

由圖3可知，在低溫處理后板凳果的SOD活性呈上升趨勢。在低溫處理48 h時，SOD活性與對照相比無明顯變化。在低溫處理96 h時，SOD活性顯著上升，是對照的1.327倍，與對照差異顯著。SOD活性升高是植株的保護性應激反應，本研究結果與張軍等[12]的研究結果相似。

2.4 低溫處理對板凳果葉片可溶性蛋白含量的影響

由圖4可知，板凳果在低溫處理后，可溶性蛋白含量呈上升的趨勢。在低溫脅迫48 h時，可溶性蛋白比對照高6.812 mg/g，但差異不顯著；在處理96 h時，可溶性蛋白含量比對照高9.929 mg/g，差異顯著。這與李釗[13]的研究結果相似。

2.5 低溫處理對板凳果葉片葉綠素含量的影響

從圖5可以看出，板凳果在低溫處理后，葉綠素各含量變化趨勢相似，在處理48 h時，類胡蘿卜素（Car）含量、葉綠素 a（Chl.a）含量、葉綠素 b（Chl.b）含量和葉綠素（Chl.a＋b）總量均升高，分別是對照的1.307倍、1.401倍、1.566倍、1.443倍，均與對照差異顯著；在處理96 h時，葉綠素各含量與48 h相比變化不大，差異不顯著。

2.6 低溫處理對板凳果葉片鈣離子濃度的影響

從圖6可以看出，板凳果在低溫處理48 h后，鈣離子濃度比對照高38.25%，且顯著高于對照；在處理96 h后，鈣離子濃度比48 h下降了15.10%，差異顯著；處理48 h和處理96 h的鈣離子濃度均顯著高于對照。

2.7 板凳果抗寒性與葉片生理指標間相關性分析

利用SPSS軟件對板凳果葉片MDA含量、相對電導率、可溶性蛋白含量、SOD活性、類胡蘿卜素含量、葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素總量和鈣離子濃度進行了相關性分析。由表1可知，板凳果的9個生理指標間存在著一定的相關性，可溶性蛋白含量和相對電導率顯著正相關；SOD活性和MDA含量之間顯著正相關；葉綠素a含量和類胡蘿卜素含量之間極顯著正相關；葉綠素總量與類胡蘿卜素、葉綠素a、葉綠素b含量均呈顯著正相關。

表1 各抗寒指標相關性分析

2.8 主成分分析

利用SPSS軟件對板凳果葉片MDA含量、相對電導率、可溶性蛋白含量、SOD活性、葉綠素a含量、葉綠素b含量、類胡蘿卜素含量、葉綠素總量和鈣離子濃度這9個指標進行主成分分析。從表2可以看出，主成分1的貢獻率為78.953%，基本把板凳果抗寒性的信息反映出來。其中，類胡蘿卜素含量、可溶性蛋白含量、葉綠素a含量、葉綠素總量、相對電導率和葉綠素b含量的系數分別為0.991，0.985，0.983，0.967，0.956 和 0.907，為較大特征向量，與板凳果抗寒性關系密切，這與相關性分析結果一致。

表2 主成分分析

3 結論與討論

相對電導率的大小直接反映了細胞膜結構和功能的受損程度。在低溫脅迫條件下，細胞膜透性增大，胞內電解質外滲，相對電導率增加[14]，植物的抗寒性和電導率呈負相關[15]。本試驗結果表明，隨著低溫的持續，板凳果的電導率呈上升趨勢，這與前人[16-17]研究結果一致，說明在低溫處理下，板凳果的細胞膜受到了損傷，導致電解質不斷滲出。

大量的研究結果表明，溫度越低或低溫處理時間越長，植物體內MDA的含量則會越多，細胞膜受到的損傷就越大。超氧化物歧化酶（SOD）是植物體保護酶系統中重要的保護酶，對保持細胞內活性氧產生與清除之間的平衡、維持細胞的完整與穩定有重要作用，并能提高植物對逆境的適應能力[18]。板凳果在低溫處理后，MDA含量不斷上升。在低溫處理48 h時，增加幅度較小，在低溫處理96 h時，MDA含量才有了較明顯的增加，這與SOD活性變化一致，說明低溫處理初期板凳果細胞膜受到的傷害較小，積累的有害物質較少，SOD活性上升幅度不大，而到了低溫處理后期，膜脂過氧化程度加重，MDA含量顯著升高，產生了大量的有害物質，SOD活性大幅度升高以清除體內產生的有害物質，從而減輕低溫對植物的傷害。

可溶性蛋白是重要的滲透調節物質，可增加細胞保水力，使植物體抗寒性提高。多數研究認為，低溫脅迫下，植物可溶性蛋白質含量增加[19]。本試驗結果表明，板凳果在低溫處理后，可溶性蛋白含量呈上升趨勢，這與嚴海燕[20]對富貴草抗寒性的研究結果一致，說明在低溫逆境下，板凳果通過增加可溶性蛋白質的含量來增加細胞保水力，從而在一定程度上提高其抗寒性。

葉綠素含量常作為反映低溫對植物傷害程度的生理指標之一。一般情況，低溫下葉綠素含量較高的植物，有利于光合作用進行，有機物積累增加，對抗寒有利[21]。本研究結果表明，隨著低溫的持續，板凳果葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量升高，這與杜春芳[22]對甘藍型油菜抗寒性研究結果一致，說明板凳果可以通過葉綠素含量的增加，促進光合作用，提高其抗寒性。類胡蘿卜素含量在整個處理過程中變化較穩定，這與郭愛華等[23]的研究結果一致，主要因為類胡蘿卜素可參與植物光合機構中過剩光能的耗散，使植物免受光抑制的損傷。

Ca2+作為耦聯胞外信號與細胞內生理生化反應的第二信使，調控多種酶活性，在植物的生長發育及植物對環境的反應與適應中有著極其重要的作用[24-25]。當細胞受到低溫環境的刺激時，胞質內Ca2+濃度水平迅速升高，高濃度的Ca2+直接或間接（通過鈣調素CaM）活化靶酶，從而產生相應的生理生化反應來抵御低溫[26]。劉雪琴[27]在探究低溫下三尖杉鈣濃度的變化時發現，低溫鍛煉可以使鈣離子濃度迅速上升，之后又恢復到靜息狀態。本試驗中，在低溫處理48 h時，鈣離子濃度升高，在處理96 h時，與處理48 h相比有所下降，但仍顯著高于對照，說明低溫處理會使鈣離子濃度升高，從而直接或間接地提高植株的抗寒性。

綜上所述，板凳果在自然低溫處理過程中，隨著低溫脅迫的持續，可溶性蛋白含量、葉綠素含量以及SOD活性不斷升高，說明板凳果可通過自我調節來適應低溫環境，從而減輕低溫造成的傷害；相對電導率、MDA含量和鈣離子濃度也呈上升趨勢，說明板凳果對低溫的調節能力是在一定范圍內的。植物的抗寒性是一個復雜的生理過程，不能僅從單項指標來評價其抗寒性。本試驗通過主成分分析和相關性分析得出，葉綠素a、葉綠素b、葉綠素含量、類胡蘿卜素含量、可溶性蛋白含量和相對電導率這6個指標與板凳果抗寒性密切。