急性鎘暴露對斑馬魚早期胚胎發育的毒性效應

楊瑞瑞，王 蘭，孫 敏，申 萍

（山西大學生命科學學院，山西太原030006）

鎘是環境中具有極強毒性的重金屬污染物之一。工農業廢棄物和生活污水的排放，使環境中的鎘污染日益嚴重。鎘可通過呼吸、吸附和攝入累積于生物體內，從而對生物體產生毒性[1]。少量鎘長期積累于生物體內會對呼吸道產生刺激，對肝、腎、生殖等造成損傷，而且對胚胎的發育產生各種不利影響[2-3]。鎘誘導生物體自由基和活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量生成，造成氧化損傷。大量研究顯示，鎘的毒性機制與機體受氧化脅迫有關[4-5]。QU等[6]和JANCSó等[7]研究表明，鎘暴露后會導致鯽魚（Carassius auratus）和鯉魚（Cyprinus carpio）的肝臟等組織中MDA含量和SOD，CAT，GPx等抗氧化酶活性發生改變。WANG等[8]將濃度為64.5，129，258，516，1 032 μmol/L 的鎘暴露于河南華溪蟹（Sinopotamon henanense）7 d后檢測鎘對精巢的毒性作用發現，隨著鎘濃度增加，SOD活性先升高后降低；MDA和H2O2含量隨鎘濃度的升高而增加。HO等[9]研究發現，濃度為2.5 μmol/L的鎘暴露于斑馬魚胚胎10 hpf后，能夠顯著下調Cu/Zn-SOD基因的表達。JIN等[10]研究表明，鎘脅迫斑馬魚胚胎96 hpf后會導致其運動行為發生顯著改變，同時，MDA含量增加，SOD等抗氧化酶活性改變。此外，急性鎘暴露會使得斑馬魚幼魚MDA含量顯著增加，GPx活性顯著下降，造成氧化損傷[11]。

斑馬魚（Danio rerio）已被廣泛應用于許多研究領域，如藥物毒理學、生態毒理學及環境檢測[12]。1998年經濟合作與發展組織（OECD）將斑馬魚胚胎毒性試驗方法列為測定單一化學品毒性的標準方法之一[13]。目前，斑馬魚胚胎已被廣泛應用于有機污染物的監測。與斑馬魚成魚相比，斑馬魚早期胚胎具有發育快、易獲得、易觀察、敏感且透明等優點。目前，鎘暴露對斑馬魚肝、腎、神經系統的毒性效應已有諸多報道，但鎘對斑馬魚早期胚胎的發育毒性機制還不清楚。

本試驗以斑馬魚早期胚胎為研究對象，探討鎘對早期胚胎的發育毒性，旨在為進一步研究鎘對胚胎原始生殖細胞的毒性效應機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試動物 試驗用斑馬魚品系為AB系，飼養于山西大學生命科學學院動物學實驗室斑馬魚養殖水循環體系中，養殖系統循環水是用反滲透凈水機制備，水溫（28.3±1）℃，電導率為450～550 μS/cm，pH值為 7.0～7.5（利用碳酸氫鈉調節），光周期為14 h光照/10 h黑暗，每天飼喂2次活豐年蝦。

1.1.2 主要儀器及試劑

1.1.2.1 主要儀器 恒溫光照培養箱（MGC-450BP，上海一恒科學儀器有限公司），體視顯微鏡（SZX16＋DP71＋IPP，日本），電動勻漿儀（F6/10，德國FLUKO公司），冷凍離心機（5804R，德國Eppendorf公司），多功能酶標儀（SpectraMax M5，美國 MD公司）。

1.1.2.2 主要試劑 氯化鎘，純度為99.0%，購于Sigma公司；丙二醛（MDA）檢測試劑盒和超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 鎘暴露試驗 收集胚胎的前1 d晚上，每個產卵缸放入雌魚與雄魚比例為1∶1或1∶2的斑馬魚成魚，雌雄魚用隔板分隔開，次日早晨待光照30 min后將隔板移去，于產卵后20 min左右收集受精卵。收集0.5 hpf內健康的斑馬魚胚胎置于玻璃皿中，每皿100顆胚胎，80 mL系統循環水。結合《漁業水質標準（GB 11607—92）》和鎘對斑馬魚胚胎發育毒性的報道[14-15]，本研究設置 0，4.44，8.90，17.80，26.70，35.60 μmol/L6 個鎘濃度。胚胎進行鎘暴露后，將其置于28.5℃光照培養箱中使胚胎繼續發育。

1.2.2 斑馬魚胚胎畸形表型觀察 胚胎經鎘暴露后發育至 2，6，10，24 hpf時，每組隨機選取 20 顆胚胎，體視顯微鏡觀察胚胎發育情況，并記錄其死亡數和畸形數。以卵凝結作為死亡終點。

1.2.3 MDA含量測定 取鎘暴露后發育至2，6，10，24 hpf的斑馬魚胚胎，各處理組分別隨機選取15顆胚胎，稱質量后置于冰上，按質量體積比1∶19加入0.75%的生理鹽水，勻漿，將勻漿液于4℃離心機（2 500 r/min，10 min）離心，取上清液。

采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定MDA含量，并根據試劑盒說明書依次加入試劑，漩渦混勻，水浴，4 ℃離心機（4 000 r/min ，10 min）離心，取 200 μL上清液，加入96孔酶標板中，酶標儀測定OD值（激發波長532 nm）。

1.2.4 SOD活性測定 采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，按1.2.3的方法將胚胎勻漿后，根據試劑盒說明書操作，取200 μL上清液，加入96孔酶標板中，酶標儀測定OD值（激發波長550 nm）。

1.3 數據分析

以上試驗均重復5～6次。所得數據使用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，通過LSD進行分析比較顯著性（P＜0.05，表明差異有統計學意義）。

2 結果與分析

2.1 鎘暴露后斑馬魚早期胚胎死亡率分析

從圖1可以看出，鎘暴露后斑馬魚胚胎死亡率隨著鎘濃度的增加均有不同程度的升高。相對于對照組，鎘暴露后胚胎發育至2 hpf時死亡率沒有明顯變化，而胚胎發育至6，10，24 hpf時，其死亡率急劇上升，且 6，10，24 hpf的胚胎在 8.90，17.80，26.70，35.60 μmol/L鎘濃度暴露下死亡率極顯著升高（P＜0.01）。

2.2 鎘暴露后斑馬魚早期胚胎畸形率分析

鎘暴露后，發育至2，6，10，24 hpf的胚胎畸形率均隨鎘濃度增加逐漸升高。如圖2，3，4，5所示，2，10 hpf的胚胎畸形率在鎘濃度為17.80 μmol/L時顯著增加（P＜0.01），而 6，24 hpf的胚胎畸形率在鎘濃度為8.90 μmol/L時極顯著升高（P＜0.01）。對照組2 hpf的胚胎發育到64細胞期，胚胎動物級均勻快速分裂（圖2-A），而鎘濃度組胚胎出現包狀突起、未分裂、異常分裂、分裂延遲甚至分裂停止等畸形表型（圖2-B～F）。

胚胎發育至6，10 hpf時，胚胎分別處于原腸期和體節期，此時可觀察到對照組胚胎分別處于50%下包（圖3-A）和3-體節時期（圖4-A），而鎘處理組中部分胚胎表現出發育滯后、外包延遲甚至引起死亡等現象（圖3-B～D，圖4-B～D）。

胚胎發育至24 hpf，主要的組織器官原基已形成。如圖5-A所示，正常胚胎可觀察到明顯的體節、眼睛以及心臟搏動等，而鎘濃度組中出現了卵黃囊水腫、心包水腫、尾部彎曲及發育滯后等多種畸形現象（圖5-B～D），且鎘濃度越高，胚胎畸形程度越嚴重，尤其在高濃度鎘處理下大部分胚胎出現卵膜被破環，內容物溢出的現象。

2.3 鎘對斑馬魚早期胚胎的氧化損傷

2.3.1 鎘對斑馬魚早期胚胎MDA含量的影響 由圖6可知，鎘暴露后，2，24hpf的斑馬魚胚胎MDA含量的變化趨勢基本一致，均隨著鎘濃度的增加逐漸升高。與對照組相比，在較低的鎘濃度（8.90μmol/L）暴露下，MDA含量沒有明顯變化；在鎘濃度高于17.80 μmol/L時MDA含量均顯著升高（P＜0.05）。

2.3.2 鎘對斑馬魚早期胚胎SOD活性的影響 由圖7可知，與對照組相比，鎘暴露后，2，24 hpf胚胎的SOD活性均發生了顯著性變化。8.90μmol/L鎘暴露后，2hpf胚胎的SOD活性顯著升高（P＜0.01），而24 hpf胚胎的SOD活性無顯著性變化；17.80 μmol/L鎘暴露下24 hpf的胚胎SOD活性被顯著抑制（P＜0.05）；35.60 μmol/L鎘暴露下，2，24 hpf的胚胎 SOD活性均被顯著抑制。

3 討論

水生動物對環境污染物的敏感程度在整個生命周期中有所不同。在魚類早期胚胎發育中，原腸胚階段和細胞分裂階段是發育的關鍵時期[16]。MCKIM等[17]對4種魚類的完整生命周期進行了毒性試驗，結果表明，胚胎、仔魚和早期幼魚是魚類尤為敏感的生命階段。因此，本試驗針對斑馬魚的早期胚胎（2，6，10，24 hpf的胚胎）進行了發育毒性研究。諸多報道指出，重金屬不僅會導致胚胎死亡率、孵化率發生變化，還會導致胚胎畸形。CHENG等[18]用濃度為1～1 000 μmol/L的鎘暴露5 hpf的斑馬魚胚胎18 h后發現，鎘可導致胚胎畸形率增加，引發頭部發育不全，色素減退，心臟水腫，卵黃囊異常和尾部畸形。辛琦等[19]研究發現，納米銀和銀離子暴露后，96 hpf斑馬魚胚胎的死亡率升高、孵化率下降，并出現體長縮短及卵黃囊腫大的畸形癥狀。與之相似的是，本研究顯示，鎘暴露后各個發育階段的胚胎死亡率和畸形率均升高，證實鎘對早期胚胎發育具有較強毒性。此外，鎘暴露下6，10，24 hpf的胚胎死亡率顯著增加，這可能是由胚胎發育至不同階段對鎘的敏感性不同所導致。如乙草胺對中華大蟾蜍（Bufo bufo gargarizans）早期胚胎的毒性研究中發現，早期胚胎對乙草胺的敏感性和耐受性因發育階段不同而有所差異，原腸胚階段是胚胎對乙草胺尤為敏感的時期[20]。與之相似，本研究中，6，24 hpf胚胎畸形率在鎘濃度較低時表現出顯著性，由此得出，6，24 hpf胚胎對鎘的敏感性較強。

抗氧化防御系統在氧化應激過程中發揮重要作用，一旦被破壞，就會導致氧化損傷。抗氧化酶（SOD，CAT）和脂質過氧化物（MDA）是檢測各種化學物質和重金屬毒性的標志物[21-22]。有關文獻表明，膜系統遭受損害與MDA有關，鎘進入細胞會破壞膜結構，導致膜功能受損[23]。HSU 等[24]報道，1，3，5，9 μmol/L鎘處理斑馬魚胚胎9 h后，MDA含量極顯著性增加（P＜0.01）。本研究顯示，17.80，35.60μmol/L鎘暴露胚胎2，24 hpf后，MDA含量發生顯著變化。推測可能是較高濃度鎘會在生物體內大量積累，誘導產生過量的氧自由基，進一步破壞機體的抗氧化系統，引起內環境失衡，膜系統損傷，從而導致MDA含量呈明顯升高趨勢。

SOD是生物體內清除氧自由基從而保護機體的第一道防線。本研究SOD活性試驗結果顯示，鎘暴露后，2 hpf胚胎的SOD活性先升高后降低。與文獻的報道相似，如JIN等[25]通過鎘對鯽魚的毒性試驗發現，隨著鎘濃度增加，SOD活性發生改變。這可能是由于鎘濃度較低時，誘發SOD活性升高，使得機體自身的抗氧化系統防御能力增強，有效去除氧自由基，防止細胞膜系統過氧化，維持機體內環境穩態；鎘濃度較高時，可能導致SOD中的金屬離子被置換，引起SOD活性下降。24 hpf的胚胎在鎘濃度為17.80，35.60 μmol/L時SOD活性均被顯著抑制，這可能是由于隨著鎘暴露時間的延長，使得胚胎鎘積累量增多，鎘會改變SOD分子構象，使其活性降低，并且使得O2-參與的經多步反應轉化為水和氧氣的氧化還原反應效率降低，從而造成氧化損傷。

綜上所述，鎘對分裂期、原腸期、體節期和咽囊期胚胎的發育均具有嚴重的毒性效應，并導致胚胎氧化損傷。研究結果為進一步探討鎘對魚類胚胎原始生殖細胞的毒性效應機制提供了理論依據。