草莓脫毒組培苗低成本快繁技術研究

張春芬，鄧 舒，聶園軍，趙海靜，肖 蓉，董艷輝，侯麗媛 ，孟玉平 ，曹秋芬

（1.山西省農業科學院果樹研究所，山西太原030031；2.山西省農業科學院農業資源與經濟研究所，山西太原030006；3.山西省農業科學院生物技術研究中心，山西太原030031）

近年來，植物組織培養技術已經由原來的實驗室研究逐步轉變為可以為大規模工廠化育苗服務的有效科技手段[1-3]，鑒于植物組織培養技術的先進性，將其應用于生產實踐無疑可以帶來巨大的經濟效益[4-5]。而在現代工廠化草莓種苗生產中，脫毒苗的組織培養是首要環節，也是重要的組成部分，在保證種苗生產質量的基礎上，提高繁殖系數、降低支出對于生產和節約能源都具有非常重要的意義[6]。

本試驗立足于生產型企業對草莓組織培養技術應用的成本控制，從碳源種類及濃度、凝固劑種類及濃度、培養容器等方面進行研究，旨在找到可行的低成本繁育技術應用于草莓脫毒種苗的大規模工廠化生產。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料取自山西省農業科學院生物技術中心實驗室草莓無病毒組培材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同碳源及濃度對草莓組培苗生長的影響分別采用蔗糖 30 g/L，白砂糖 30，25，20，15 g/L 處理。每瓶接3株，每處理10瓶，重復3次，繼代培養25 d后，調查統計不定芽增殖的變化情況。

增殖系數＝總增殖芽個數/總接種芽個數（1）

1.2.2 不同凝固劑及濃度對草莓組培苗生長的影響 分別采用5.0%，6.0%，6.5%瓊脂粉和5.0%，6.0%，6.5%卡拉膠處理。每瓶接3株，每處理10瓶，重復3次，繼代培養25 d后，調查統計不定芽增殖的變化情況。

1.2.3 不同培養容器對草莓組培苗生長的影響分別采用 150，300 mL 三角瓶和 180，240，350 mL玻璃瓶處理。每瓶接3株，每處理10瓶，重復3次，繼代培養25d后，調查統計不定芽增殖的變化情況。

1.2.4 不同糖濃度對草莓組培苗生根的影響 分別采用白砂糖 5，10，15，20，30 g/L處理。基本培養基為1/2 MS，添加0.3 mg/LIBA。每瓶接3株，每處理10瓶，重復3次，接種28 d后統計生根情況。

1.2.5 培養基及培養條件 以上培養基采用MS為基本培養基，均添加0.5mg/L6-BA，0.1mg/LIBA[7]，3%蔗糖和6.5 g/L瓊脂，pH值為5.8，培養基121℃滅菌20 min，自然冷卻后備用。培養條件為：溫度（25±2）℃，14 h 光照，光照強度為 3 000 lx。

1.3 低成本生產效益核算

本試驗中采用MS培養基為基本培養基，以MS培養基配方中的各化學物質成本進行計算，價格為目前市場售價（2016年）。

2 結果與分析

2.1 不同碳源及濃度對草莓組培苗生長的影響

從表1可以看出，在繼代培養中，培養基中添加30 g/L蔗糖與白砂糖對4種草莓脫毒苗的增殖系數都無明顯影響，增殖系數分別為紅顏8.43/8.23，豐香 6.21/6.13，甜查理 7.99/7.95，章姬8.01/7.98；組培苗生長表現正常，植株比較健壯，說明無論蔗糖還是白砂糖都能給草莓脫毒苗提供足夠的碳源，滿足其正常生長。然而，蔗糖的價格明顯高于白砂糖，一般是白砂糖的3～4倍，因此，考慮到生產成本，工廠化規模生產中完全可以用白砂糖代替蔗糖。比較20，25，30 g/L不同白砂糖質量濃度可知，其沒有明顯差異，15 g/L小苗生長瘦弱，且略顯發黃，由于碳源不足對組培苗的生長有一定的影響。在草莓的組培苗生長過程中，20，25，30 g/L白砂糖之間不存在顯著差別，考慮到成本，在工廠化生產中可以用20 g/L的白砂糖代替30 g/L的蔗糖。

表1 不同碳源及濃度對草莓組培苗生長的影響

2.2 不同凝固劑及濃度對草莓組培苗生長的影響

表2 不同凝固劑對草莓（紅顏）組培苗生長的影響

由表2可知，不同凝固劑濃度對組培苗的增殖系數存在一定的影響。其中，5.0%瓊脂粉和5.0%卡拉膠為凝固劑時，培養基為半凝固狀態，組培苗增殖少，而且呈現玻璃化；凝固劑濃度較大時即7.0%瓊脂粉和7.5%卡拉膠為凝固劑時，培養基呈現不透明狀態，硬度變大，組培苗生長健壯，但是增殖系數減少，分別只有4.56和4.54；6.0%瓊脂粉和6.5%卡拉膠為凝固劑時，培養基硬度適中，組培苗生長健壯，且增殖系數較大。比較2種不同的凝固劑對草莓組培苗的增殖情況可知，二者之間差異不顯著，但是，與瓊脂粉相比，卡拉膠相對較便宜，從生產成本考慮，最適合的凝固劑用量為卡拉膠6.5 g/L。

2.3 不同培養容器對草莓組培苗生長的影響

從表3可以看出，組培瓶的大小對草莓組培苗的生長影響不大，封口方式顯著影響了草莓組培苗的增殖。其中，紅顏在350 mL帶蓋的大瓶中增殖系數最大，為7.21；其次為250 mL三角瓶，增殖系數為6.60；180 mL帶蓋的培養瓶增殖系數為6.25，三者之間差異不顯著。豐香在350 mL帶蓋的組培瓶、250 mL三角瓶和180 mL帶蓋的培養瓶的增殖系數分別為3.95，4.00，3.90，三者之間差異不顯著。使用塑料膜封口的組培苗在繼代培養14 d后，培養基由透明轉為不透明，在植株基部出現裂縫，培養基開始變硬，增殖系數相較于塑料蓋下顯著降低，紅顏草莓在180，350 mL塑料膜封口的培養瓶內的增殖系數分別為3.31和3.75，豐香則僅為1.80和2.00。

表3 不同培養容器對草莓組培苗生長的影響

2.4 不同白砂糖濃度對草莓組培苗生根的影響

草莓的組培苗極易生根，在不添加任何激素的1/2 MS培養基中也能生根。從表4可以看出，在相同的激素水平下，不同白砂糖質量濃度對生根有一定的影響，較低的白砂糖濃度時，生根量少且纖細，10，15 g/L之間生根量差異不顯著，但是根系生長情況有所不同，相對于15 g/L處理，10 g/L白砂糖質量濃度，根系纖細而且較短，不利于植株的移栽。15，20，30 g/L白砂糖之間生根條數差異不顯著，且根系都較粗，移栽成活率高。綜合生產成本考慮，生根用培養基白砂糖質量濃度以15 g/L為宜。

表4 白砂糖不同質量濃度對生根的影響

2.5 培養成本核算

從表5可以看出，不考蔗糖和瓊脂粉，配制1 L的MS培養基需要藥品總成本約為0.21元，添加蔗糖30 g、瓊脂粉6.0 g，則費用增加為2.47元，其中，蔗糖1.296元，占到總成本的52.5%，瓊脂0.96元，占到總成本的38.9%。因此，降低培養基配制成本要重點放在蔗糖和瓊脂粉的成本方面。

由表6可知，用白砂糖替換蔗糖，成本可降低1.096元；卡拉膠替換瓊脂粉，成本可降低0.57元，總成本降為原來的32.5%（0.803/2.469），在大規模的工廠化生產中，培養基的需求量很大，這樣可大大節約總的生產成本。

表5 基本培養基（MS）成本

表6 降低成本前后培養基比較（1 L）

2.6 培養容器成本核算

從表7可以看出，以接種1 000瓶脫毒苗為例，使用250 mL三角瓶，1 000個三角瓶的容器成本為5 000元，培養基要配置40 L才能滿足分裝，總成本為5 032.1元；相同條件下，用350 mL培養瓶需要40 L培養基和3 000元容器成本，如果換成180 mL培養瓶則只需要25 L培養基和2 500元容器成本；同時，三角瓶封口一般以塑料膜封口，需用棉線捆綁，費時費力，而培養瓶采用塑料蓋封口時快速省時，節約了勞動力，從而節省了培養成本，為草莓脫毒苗的規模化工廠化生產提供了節約時間、降低成 本的途徑。

表7 培養容器的培養成本

3 結論與討論

草莓脫毒苗的工廠化生產過程分為3步，首先是原原種苗，即脫毒種苗的繁育；其次是原種苗，即由原原種苗匍匐莖出芽獲得的二級子苗；第3步為生產苗的繁育，是通過原種苗的匍匐莖出芽獲得的三級子苗[8]。原原種苗的生產主要采用組織培養技術，因此，生產企業要想在大規模中取得更大的生產效益，必須考慮降低組培苗的生產成本，而培養基是組培苗成本的重要組成部分[9]，通過降低培養基成本是控制成本的重要方法之一。

本研究表明，蔗糖在培養基配制中用量大，成本也高，占到培養基成本的52.5%。其主要作用是為植物提供碳源和維持培養基中滲透壓，因此，糖濃度的變化可以調節滲透壓，并因此影響到植物的生長發育。大多數試驗多以蔗糖為碳源[10-12]，本研究發現，用白砂糖代替蔗糖同樣可滿足草莓生長發育的需求，而且將白砂糖質量濃度降到20 g/L時，草莓苗仍可健壯生長，很大程度上降低了生產成本。

同碳源相似，凝固劑在培養基總成本中也占有較大的比例，是工廠化育苗成本過高的原因之一[13-14]。大多數研究中，選用瓊脂粉作為凝固劑，而瓊脂粉在培養基中只起到凝固培養基的作用，它并不是植物生長中必不可少的，本研究中，采用較便宜的卡拉膠來代替瓊脂，草莓植株的生長沒有受到明顯的影響。本研究表明，隨著瓊脂粉濃度的降低，培養基硬度變小，甚至不能完全凝固，從而導致瓶內相對濕度較大，接種時很難固定在培養基中，接種后草莓苗易玻璃化。因此，在實際生產過程中，也不能一味地降低成本，要同時兼顧苗木質量，在組培繼代中，隨時觀察繼代不同代數后苗木的質量，從而對培養基中的瓊脂粉予以調整。

在植物組培苗的工廠化生產中，由于培養容器的需求量較大，因此，價格低廉、操作簡便的容器可大幅度降低生產成本[15]。一般實驗室里進行組織培養所用容器都用玻璃三角瓶，由于其透光性好，特別適于科學研究，但其價格昂貴且易碎，不利于工廠化生產操作，在工廠化大規模的生產中會相應地增加生產成本[16]。現在生產中，多用塑料瓶或玻璃瓶代替三角瓶進行大規模生產[17-18]，不僅價格便宜，而且便于洗滌和接種工人大批量操作，可節省勞動力，有效地降低生產成本，極大地提高生產效率。