部分玉米種質南繁區自然條件下抗銹性評價

劉秀峰，吳紅宇，樓辰軍，楊兆順，袁文婭，許高平

（1.天津市農作物研究所，天津300381；2.禾雨鑫農業技術開發有限責任公司，河北涿州072750）

玉米銹病是影響玉米生產的重要病害，在已報道的4種玉米銹病中[1]，我國主要發生的有由玉米柄銹菌（Puccinia sorghi Schw.）引起的普通玉米銹病和由玉米多堆柄銹菌（Puccinia polysora Underw.）引起的玉米南方銹病。其中，普通玉米銹病是我國東北地區玉米發生的主要類型，華北、華南和西南等地區也是普通玉米銹病的發生區域[2]。一般認為，該病害對玉米產量影響不大，但近年有為害加重的趨勢。玉米南方銹病于1891年首次在鴨茅狀摩擦禾（Tripsacum dactiloides）干標本上被發現，于1897年被正式定名[3]。玉米南方銹病于1950年在西非多個國家大流行，造成嚴重損失。在此之前，西非的玉米銹病均為普通型銹病，對玉米產量影響很小[4]。在我國，20世紀70年代發現了玉米南方銹病在海南、臺灣發生為害[2，5]。隨著氣候及耕作制度的變化，加之當前生產上主要玉米品種缺乏抗銹性，玉米南方銹病由僅為害南方玉米區逐步向北方玉米種植區擴展。1997—1998年玉米南方銹病在浙江淳安縣、河北省邯鄲、滄州地區以及山東、河南、江蘇大面積暴發[6-7]。2015年玉米南方銹病在黃淮海夏玉米產區大流行，造成嚴重減產[8]。目前，玉米南方銹病在全國20多個省份均有報道，由于該病害可遠距離傳播，病原菌可能隨強氣流在更大的區域擴散。

布局抗病品種是控制玉米銹病經濟、安全的措施，多國推廣抗病品種防治玉米銹病已取得明顯成效[9]。國內學者發現，不同玉米品種、自交系對銹菌的抗性差異很大[10-16]，玉米種質抗性水平差異明顯，為培育抗病品種提供了可能。玉米育種除考慮抗病特性外，還需要綜合考慮結實性等豐產性狀，已報道的玉米品種（品系）抗銹性多為在當地輔以人工接種進行的抗性鑒定。

本研究于海南三亞南繁區玉米銹病自然發生條件下，對創制的部分玉米種質進行抗銹鑒定與評價，旨在了解這些玉米種質對玉米銹病的抗性水平，以期為培育兼具豐產性和抗銹性的玉米品種篩選骨干種質。

1 材料和方法

1.1 材料

供試玉米種質共161份，其中，蘭卡斯特（Lancaster）群、瑞德（Reid）、Lancaster/衣阿華瑞德黃馬牙（Iodent）、黃早四/Iodent以及Reid/黃早四、Reid/Lancaster、黃早四/旅大紅骨改良系分別為3，5，5，8，43，29，66 份，除對照自交系外，其余各玉米種質均為筆者選育創制。

1.2 方法

試驗點設在海南省三亞市黃流鎮，每份種質種植5行區，最終每行留苗25株。至散粉期未噴施殺菌劑。

1.2.1 玉米銹病病原鑒定 在玉米進入散粉期，采集發病病葉，用4%戊二醛固定后掃描電鏡觀察。刮取葉片上銹菌孢子，液氮研磨，用CTAB法提取玉米樣品中銹菌的DNA，利用CROUCH等[17]設計的區分普通銹菌和南方銹菌的2對引物POLYF/POLYR和COMF/COMR（POLYF序列為 5′-ccaagaggtacac ctgtttgagt-3′，POLYR 序列為 5′-CATTATTACACAT CAAGTCAATCCA-3′；COMF 序列為 5′-CCAAAAG GCACACCTGTTTGAGT-3′，COMR 序列為 5′-AATT ATTACACATCAAGTCAATCCA-3′）對樣品中銹菌分別進行PCR擴增。然后分別利用低熔點瓊脂糖回收片段，連接pTZ57R/T載體。轉化后每個樣品挑選至少3個陽性克隆重復測序。將序列分別在NCBI進行Blast比對。引物由蘇州金唯志生物技術有限公司合成，序列測定由北京信諾金達生物科技有限公司完成。

1.2.2 玉米銹病調查方法 銹病調查在玉米散粉期進行，每份種質調查5行，每行連續調查25株。發病嚴重度按照傅俊范等[18]玉米銹病調查標準進行病情分級：0級，葉片上無可見病斑；1級，發病面積占葉面積5%以下（包括5%）；2級，發病面積占葉面積5%～10%（包括10%）；3級，發病面積占葉面積10%～25%（包括25%）；4級，發病面積占葉面積25%～40%（包括40%）；5級，發病面積占葉面積40%～65%（包括65%）；6級，發病面積占葉面積65%以上。

2 結果與分析

2.1 玉米銹病病原菌鑒定

玉米散粉期黃流鎮田間銹病自然發生較為普遍，夏孢子堆分布于葉片正面，淡黃色，呈卵圓形。采集發生銹病的病葉，用4%戊二醛固定液抽氣固定，掃描電鏡觀察到夏孢子表面具有交錯排列的較密集的刺突，刺突基部外圍有近圓形凹陷的脊（圖1）。部分刺突傾倒可能是由樣品抽氣處理所導致。

利用引物POLYF/POLYR對20個玉米銹病病原菌的rDNA進行PCR擴增，18個標樣均能得到約300 bp的單一片段（圖2），對該片段用低熔點瓊脂糖回收、T載體克隆測序，分析表明，各擴增片段序列為288 bp，序列間堿基相似性為100%。Blast比對結果顯示，三亞市黃流鎮玉米銹病病原菌擴增序列與CROUCH等[17]登錄的玉米南方銹病病原菌（GenBank：HQ189432）的堿基序列相似性為99%。利用引物COMF/COMR對上述20個銹病病原菌進行PCR擴增，未得到可辨產物。這些結果顯示，本研究南繁種植點玉米銹病病原菌為玉米多堆柄銹菌（Puccinia polysora Underw.）。

2.2 玉米種質對南方銹病的抗性表現

通過在玉米散粉期進行銹病田間調查，明確了創制種質對南方銹病的抗性等級（表1）。供試的161份玉米種質中，對照種質黃早四高感南方銹病；對玉米南方銹病抗性表現為 1，2，3，4，5級的材料分別占總種質的42.86%，19.25%，16.15%，13.04%和8.07%；未發現對玉米南方銹病免疫的種質材料。表現抗病及高抗的種質有100份，高感的種質有14份（表1）。

表1 玉米種質對南方銹病抗性表現

結果表明，不同玉米種質對南方銹病的抗性存在明顯差異。供試的Lancaster，Reid以及Lancaster/Iodent改良系的抗病性表現為高抗和中抗。Reid/Lancaster改良的29份種質中表現抗病和高抗的有22份，中度抗病的有5份，僅有2份表現為感病。高感南方銹病但結實性優良的黃早四分別和Iodent，Reid改良后，各自有接近1/2的改良材料表現為抗病或者高抗（表1）。黃早四與旅大紅骨改良的種質中，43份（占比65.2%）表現抗病及高抗，12份（占比18.2%）種質材料高感南方銹病。熱帶種質自交系8085泰高抗玉米南方銹病。本研究中，玉米種質的大多數對南方銹病表現抗病或中度抗病，而含有熱帶血緣的材料表現高度抗病，這與前人的研究結果一致。通過本研究鑒定篩選的這些材料對玉米抗銹育種具有重要價值。

3 結論與討論

海南、廣東、廣西、福建、臺灣、云南、貴州、山東、陜西、山西、河北等地玉米普通銹病和南方銹病2種病害都有發生，尤其是玉米南方銹病在我國發生范圍逐步北擴，已在我國多個省份多次發生大流行，目前已經成為南方和黃淮海玉米主產區的一種主要病害。分析其流行的原因，可能與當前主栽品種鄭單958、先玉335等品種抗性差[18]、病原菌小種的適應性[19]有一定的關系；另外，強氣流北上加快了銹菌夏孢子在玉米產區的傳播速度，可能促使玉米南方銹病發生范圍向北擴展。

由于種植戶防治玉米病害管理措施粗放以及玉米生長后期施藥困難的特點，面對玉米銹病加重發生的嚴峻形勢，解決生產上的病害問題，急需加強玉米抗銹性研究和品種選育，篩選適宜當地種植的抗性品種，遏制玉米銹病的流行勢頭。同時，玉米抗銹品種選育除考慮其抗病特性外，還應考慮品種豐產性、脫水性、抗倒性以及環境適應性等多個因素。試驗證明，一些熱帶種質具有優良的抗銹性，但由于生育期長、適應性差、品質差等原因難以直接用于玉米育種。Lancaster群、Reid群、Iodent群以及旅大紅骨群被育種者普遍認可，將熱帶種質導入這些優勢群的代表自交系，經多代回交轉育有望獲得優良抗銹種質材料進而配制玉米新組合。由于育種方向原因，筆者的種質中未使用抗銹性十分突出的齊319[20]，而是充分利用Lancaster群、Iodent群和Reid群種質的抗病性，輔以8085泰等不同的抗源材料導入這些優勢群的優良自交系。同時試驗結果說明，優良自交系黃早四與Reid群改良材料中高抗玉米南方銹病的種質少，而黃早四/旅大紅骨改良材料中高抗玉米南方銹病的比例較高，有望篩選出兼具豐產性、適應性和抗銹性的種質材料。