重組UK114蛋白編碼基因的序列特征及表達分析

張曉紅，宋彩麗，殷惠軍，尹淑琴，常 泓

（1.山西農業大學生命科學學院，山西太谷030801；2.山西農業大學期刊社，山西太谷030801）

UK114（山羊肝臟腫瘤抗原）蛋白是鈣激活蛋白酶激活蛋白，是μ-calpain的激活蛋白，UK114蛋白是一種低分子量的保守蛋白質，該蛋白質廣泛存在于真核和原核類生物中[1]。在UK114蛋白質家族中大約有200多個同源物，表明此類蛋白質在生物體內起著重要的作用[2]。

UK114是UK101蛋白組成之一。分子量約為14 ku。UK101是BARTORELLI等[3]在 1994年從山羊肝臟中發現的一種高氯酸可溶性蛋白，這種蛋白是抗原性的，研究發現，該蛋白質具有抗腫瘤活性。UK101主要由3種不同大小分子量的蛋白質構成：UK110，分子量大小為10 ku；UK114，分子量大小約為14 ku；UK150，分子量大小為50 ku，是富含甘露糖的蛋白質[4-5]。MELLONI等[6-7]研究發現，UK114 蛋白是calpain-1的激活蛋白；PONTREMOLI等[8]對該蛋白的氨基酸順序進行了測定。朱宏等[9-10]在山羊肝臟中克隆了UK114蛋白基因，研究了它在肉嫩化機理中的作用。在UK114蛋白家族中，尤其是DUK114（果蠅體內UK114的同源物）蛋白，它的結構是保守的，且其功能是由其結構特點決定的[11-12]。FARKAS等[11]研究表明，DUK114是一種分子伴侶，它與Hsp90有相似的功能。CSERMELY等[12]研究推測，DUK114蛋白的調控是發生在蛋白質水平，而不是細胞水平。

蛋白質是生命活動中功能的主要承擔者，為此，本研究對該類蛋白質進行了生物信息學分析，主要是對其蛋白質的理化性質、亞細胞定位、蛋白質互作關系以及蛋白質高級結構的預測[13]。由于蛋白質的種類繁多，一些技術不能普遍使用，生物信息學的出現，為蛋白質二、三級結構的獲得提供了捷徑[14-15]。之前大多都是研究這些基因的結構和功能，對蛋白質的研究相對較少。

本研究通過從山羊肝臟中提取總RNA，經RT-PCR獲得目的基因，利用生物信息學分析技術，對其編碼的蛋白序列進行結構分析，從而更加清楚地了解其產生功能的機制，為其奠定理論基礎，也為后期深入研究UK114蛋白結構功能等研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料 將新鮮的山羊肝臟組織（取自山西省太谷縣范村），用剪刀剪成數塊，用錫箔紙包好，置于液氮罐中帶回，放到-80℃冰箱保存。

1.1.2 試劑 總RNA抽提試劑盒，RT-PCR試劑盒，DNA Marker 2 000，Taq DNA 聚合酶，dNTP，瓊脂糖，均購自索萊寶公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計 參考GenBank提供的山羊UK114核酸序列，使用Primer 5.0在線軟件設計引物，由北京擎科新業生物技術有限公司合成，序列如下。

正向：5′-AAGGATCCATGTCGTCTTTGG-3′；反向：5′-GAACTCGAGTTAGAGTGATGCTGTC-3′。

1.2.2 總RNA抽提與RT-PCR 使用總RNA提取試劑盒提取總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA濃度，使用RT-PCR試劑盒對RNA進行反轉錄和PCR 擴增，反應體系為 50 μL：ddH2O 為 36.5 μL，10×PCR Buffer為 5 μL，dNTPS 為 1 μL，引物 1 為1 μL，引物 2 為 1μL，Taq酶為 0.5 μL，反轉錄 cDNA為5μL。

PCR反應程序：94℃預變性2 min；94℃高溫變性30 s，55℃低溫退火30 s，72℃延伸 1 min，30個循環；然后72℃延伸5 min，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用膠回收試劑盒進行膠回收純化，送去生工公司測序。

1.2.3 生物信息學分析 本次試驗中生物信息學分析均采用網上在線軟件，即運用ExPasy-Prot-Param在線軟件分析蛋白質的基本理化性質；運用SignalP 4.1 Server，ExPASY-ProtScale分別進行蛋白質信號肽預測和疏水性分析；運用NetPhos 3.1 server，Prosite在線軟件分析其磷酸化位點，運用NetNGlyc 1.0 Server，NetNGlyc 4.0 Server在線軟件分析N-糖基化位點和O-糖基化位點；運用SOMPA，SWISS-MODEL分別對蛋白質的二級結構和三級結構進行預測分析[16]。

2 結果與分析

2.1 RT-PCR結果分析

使用總RNA提取試劑盒提取總RNA后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA濃度，使用RT-PCR試劑盒對RNA進行反轉錄和PCR擴增，再用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1所示。由圖1可知，該克隆目的基因約為414 bp，與預期結果一致。其中泳道1，2，3號條帶顏色較淺，說明DNA濃度較低，4，5號泳道條帶較亮，符合進行后續試驗要求。

2.2 UK114基因測序及編碼蛋白質的理化性質分析

測序結果如圖2所示，該基因序列的長度為414 bp，編碼137個氨基酸。

使用ExPasy-ProtParam軟件分析該基因編碼的蛋白質理化性質，結果表明，該蛋白由137個氨基酸殘基組成，分子量約14.3 ku；理論等電點為6.19。由表1可知，UK114蛋白質氨基酸序列中丙氨酸（Ala）含量最高，占到15.3%；其次是纈氨酸（Val），占到10.2%；組成蛋白質的20種氨基酸中不含組氨酸（His）和色氨酸（Trp）。

表1 UK114蛋白質氨基酸含量

2.3 蛋白質疏水性、磷酸化位點和模體分析

氨基酸標度是給每種氨基酸指定的數值，如分子質量、密碼子數等，Hphob./Kyte&Doolittle代表氨基酸指定的數值，可測定蛋白質的親疏水性。如圖3所示，該蛋白親水性最強區域在90～100，疏水性最強區域在80左右。

蛋白質的磷酸化主要發生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基上。經NetPhos 3.1-磷酸化位點分析，如圖4所示，有7個潛在的磷酸化位點，其中包括4個絲氨酸位點和2個蘇氨酸位點。蛋白質模體也成為保守結構域，蛋白質的保守結構域決定了蛋白質在進化上的穩定性，與蛋白質功能密切相關，對了解一個蛋白質很重要。從圖5可以看出，該蛋白質的保守結構域位于C端，第105～123個氨基酸之間。

2.4 蛋白質信號肽及糖基化預測

信號肽作為重要的細胞因子起作用，如圖6所示，Signal-IP信號肽預測，最大c值（cleavage site score，剪切位置分值）為0.169，最大s值（signal peptide score，信號肽分值）為0.183，最大y值（combined cleavage sitescore）為 0.155；從圖 6 還可以看出，UK114蛋白沒有信號肽。如圖7所示，經過NetNGlyc1.0 Sever-N-糖基化位點分析表明，重組UK114蛋白沒有糖基化位點。

2.5 蛋白質二級結構預測

使用SOPMA軟件對UK114蛋白二級結構進行分析，結果如圖8所示，該蛋白質由35.04%的α螺旋（Hh）、37.23%的無規則卷曲（Cc）、21.17%的 β折疊（Ee）和6.57%的β轉角（Tt）組成。其中，α螺旋和無規則卷曲為主要結構，β轉角含量相對較少。

2.6 蛋白質三級結構預測

蛋白質三級結構的預測，對其功能研究、細胞組織中定位、藥物設計等方面有著重要的作用。由圖9可知，α螺旋主要位于N端，β折疊主要位于C端，上邊已知保守區域在氨基酸的C端。因此，推測該蛋白的功能區域主要位于N端的α螺旋區域。

3 結論與討論

蛋白質中氨基酸的排列順序決定了蛋白質的一級結構，一級結構決定了高級結構，高級結構決定了蛋白質的具體功能，所以蛋白質的功能與氨基酸的排列順序密不可分。蛋白質中氨基酸不同種類的含量決定了氨基酸的親疏水性，也決定了蛋白質的等電點，所以是否含有特征性的氨基酸對了解蛋白質的功能起決定性的作用。本研究獲得一段完整的開放閱讀框基因序列，由414個核苷酸組成，可以編碼137個氨基酸，分子量為14 ku，等電點為6.19，整體偏弱酸性；氨基酸序列中丙氨酸含量最高。

蛋白質的疏水性對蛋白質的穩定性、構象和蛋白質功能具有重要意義[17]。信號肽的作用是為了保證其在內質網中完成初步的N－連接糖基化修飾以及折疊[18]，糖基化對蛋白質有重要的修飾作用，可以影響蛋白質的結構，也可以增強蛋白質的穩定性[19]，蛋白質糖基化修飾中N－連接糖基化修飾是最常見的蛋白糖基化修飾[20]，該蛋白中沒有信號肽，可能因此導致也沒有糖基化位點，所以該蛋白穩定性不高，這可能會給后續試驗帶來一定的難度。蛋白質的磷酸化和去磷酸化在生物體蛋白質翻譯后修飾體系中起著非常重要的作用[21]，本蛋白有23個磷酸化位點，其中，絲氨酸和蘇氨酸位點較多，因此，它可能參與細胞的信號轉導、分裂等生理生化過程。

認識蛋白質的二級結構是了解蛋白質的折疊模式和三級結構的基礎，并為研究蛋白質的功能以及它們之間的相互作用模式提供結構基礎[22]，預測蛋白質二級結構結果顯示，α螺旋占到了35.04%，不規則卷曲占到37.23%，β折疊占13.14%。蛋白質三級結構的預測可以指導藥物設計、組織定位及功能研究等各個方面的工作[23]。本研究用SWISSMODEL在線軟件對UK114的氨基酸進行三級結構預測，結果表明，N端主要是α螺旋，C端主要是β折疊，保守區域也在氨基酸的C端。因此推測該蛋白的功能區域主要位于N端的α螺旋區域，在之后的研究中可將研究重點放到對α螺旋的研究上。