FGF7亞家族在胚胎期小鼠毛囊形成過程中的差異表達

吳晉強 ，曹 靖 ，程笳琪 ，閆瑞琴 ，陸 娜 ，張嬌嬌 ，吳佳豪 ，張鵬翔 ，赫曉燕

（1.山西農業(yè)大學動物科技學院，山西太谷030801；2.北京農業(yè)職業(yè)學院，北京102442）

毛囊是動物最復雜的微型器官之一，具有重建自身的能力[1-4]。毛胚細胞（Hair germs cell）被確認是早期的毛囊前體細胞。當表皮基底層細胞下陷進入被聚集的間充質細胞包圍的真皮中時，形成毛胚細胞；毛胚細胞繼續(xù)伸長之后被稱為毛腳或毛釘。被相關間充質細胞包圍的毛釘變平的末端，形成一個球根狀凹面的結構[5]，形成凹狀面的上皮細胞變成基體，并產生內根鞘和纖維。毛囊兩側的剩余間充質細胞變成外根鞘，在毛囊的中部區(qū)域細胞組織形成皮脂腺的原基和隆起部分[6]。有研究表明，小鼠胚胎第13天是毛囊形成前期，毛胚細胞沒有明顯向下凹陷；胚胎第14天毛囊形成開始，毛胚細胞向下凹陷；胚胎第15天毛胚細胞繼續(xù)向下凹陷形成毛釘；胚胎第16天時向下凹陷形成球根狀毛釘；胚胎第17天時毛囊初步形成[1-2]。

成纖維細胞生長因子（Fibroblast growth factors，F(xiàn)GF）家族可分為7個亞家族，其中，F(xiàn)GF7亞家族成員包括 FGF7，F(xiàn)GF10，F(xiàn)GF22[7-8]。FGF7 又稱為角質形成細胞生長因子（Keratinocyte growth factor1 KGF1）[9]，其是上皮細胞的特異性促分裂原，對上皮細胞旁分泌介質起到增殖的作用[10]；FGF10是一個典型的旁分泌型FGF[11]，其以旁分泌的方式介導間充質與上皮信號傳導，在腺體、被毛、牙齒等器官中發(fā)揮重要的作用[12]；FGF22與FGF7和FGF10不同，F(xiàn)GF22蛋白質缺乏大多數(shù)分泌型FGF應有的特征，即N-糖基化的共有序列，因此，F(xiàn)GF22的表達相對受限[13-14]。

FGF7亞家族在毛囊發(fā)育領域的作用受到越來越多的關注。然而，有關FGF7亞家族對小鼠胚胎毛囊形成作用的研究未見報道。

本試驗將選取 13～17 d（E13d～E17d）的胚胎期小鼠作為試驗材料，利用免疫組織化學和Western blot方法研究FGF7亞家族成員在胚胎期小鼠毛囊形成過程中的表達，旨在了解FGF7亞家族在小鼠胚胎毛囊形成過程中的作用，為進一步揭示胚胎期小鼠毛囊的形成及調控機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

兔Streptavidin-HRP試劑盒（康為）；兔抗FGF7多克隆抗體（美國Thermo）；兔抗FGF10多克隆抗體（美國 Santa Cruz Biotechnology）；兔抗 FGF22多克隆抗體（美國Novus Biologicals）。

1.2 試驗動物及取材

50只ICR小鼠購自山西醫(yī)科大學（40只小鼠為雌性小鼠，10只小鼠為雄性小鼠）。晚上將雄鼠和雌鼠按1∶4的比例合籠，第2天早查看母鼠陰道栓進行分籠，并標記為懷孕第1天。13～17 d每天取1只孕鼠，處死后取3個完整的胚胎放入Bouin氏固定液中固定24 h后，常規(guī)制片，片厚6 μm，用于免疫組織化學分析[15]。另外3只胚胎取其背部皮膚快速放入液氮中，用于提取總蛋白。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學 根據(jù)兔Streptavidin-HRP試劑盒說明書，在組織切片上滴加試劑盒中的試劑。將組織切片的一側與以下抗體一起孵育：1∶60稀釋的兔抗FGF7多克隆抗體；1∶45稀釋的兔抗FGF10多克隆抗體；1∶50稀釋的兔抗FGF22多克隆抗體。將組織切片的另一側在PBS中于4℃溫育14 h，在室溫下儲存30 min后，將組織切片在振蕩器上洗滌3次，每次3 min。將組織切片用山羊抗兔二抗溶液在室溫下孵育10 min。洗滌后，將組織切片孵育DAB色溶液，隨時觀察顯色狀況，直至獲得最佳結果。用LEICA DMLB2的Leica光學顯微鏡采集圖像。

1.3.2 Western blot檢測 取液氮罐中保存的小鼠皮膚組織，按總蛋白提取試劑盒（碧云天）提供的操作步驟提取小鼠皮膚的總蛋白，使用ND-1000微量核酸蛋白測定儀測定其濃度。每個樣品的總蛋白量為400 μg，在15%的SDS-PAGE進行電泳分離，電泳完畢后轉移至NC膜；將NC膜放入5%的脫脂蛋白干粉對其進行封閉1 h，4℃孵育一抗過夜（FGF7兔抗多克隆抗體1∶800；FGF10兔抗多克隆抗體1∶500；FGF22兔抗多克隆抗體1∶700）。次日復溫30 min后，用TBST洗膜，共洗3次，每次10 min。加入經(jīng)TBST溶液稀釋的二抗（1∶12 000，HRP-山羊抗兔IgG，康為世紀公司），37℃孵育90 min。用TBST洗膜，共洗4次，每次5 min。運用ECL試劑盒在暗室中進行曝光之后，對其信號條帶進行掃描。利用 Image J分析 FGF7，F(xiàn)GF10和FGF22蛋白和β-actin蛋白條帶灰度值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

免疫組化光密度值用平均值±標準差表示，Western blot統(tǒng)計結果利用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 免疫組織化學試驗結果

2.1.1 FGF7免疫組織化學試驗結果 試驗結果顯示，在E13d，F(xiàn)GF7蛋白表達相對較弱；在E14d～E16d，F(xiàn)GF7主要在毛胚細胞、毛釘、球根狀毛釘、表皮和真皮細胞中觀察到；在E17d，F(xiàn)GF7主要在表皮細胞中表達，并且在球根狀毛釘中幾乎沒有觀察到陽性FGF7信號（圖1）。光密度數(shù)據(jù)分析結果顯示（表 1），F(xiàn)GF7 蛋白在 E14d，E15d，E16d 和 E17d的表達量分別是E13d的1.712倍（P＜0.001），1.670 倍（P＜0.001），1.376 倍（P＜0.001），1.280 倍（P＜0.001，圖 2-A）。

2.1.2 FGF10免疫組織化學試驗結果 試驗結果顯示，F(xiàn)GF10蛋白主要在毛胚細胞、毛釘、球根狀毛釘、表皮和真皮細胞中觀察到。FGF10蛋白在E15d陽性反應最強；在E14d和E16d，主要在表皮細胞中觀察到FGF10。隨著時間的推移，F(xiàn)GF10陽性信號逐漸減弱（圖3）。光密度數(shù)據(jù)分析結果顯示（表1），F(xiàn)GF10 蛋白在 E14d，E15d，E16d 和 E17d 的表達量分別是E13d的1.461倍（P＜0.001），1.917倍（P＜0.001），1.545 倍 （P＜0.001），1.129 倍 （P＜0.001，圖 2-B）。

表1 FGF7/10/22蛋白在小鼠皮膚中陽性反應物的平均光密度

2.1.3 FGF22免疫組織化學試驗結果 試驗結果顯示，F(xiàn)GF22蛋白在毛胚細胞、毛釘、球根狀毛釘、表皮和真皮細胞中均有廣泛表達（圖4）。光密度數(shù)據(jù)分析結果顯示（表1），F(xiàn)GF22蛋白在E13d，E15d，E16d和E17d的表達量分別是E14d的1.031倍（P＜0.05），1.136 倍 （P＜0.001），2.086 倍 （P＜0.001），2.324 倍（P＜0.001，圖 2-C）。

2.2 Western blot試驗結果

Western blot試驗結果顯示，F(xiàn)GF7，F(xiàn)GF10 和FGF22在不同日齡小鼠的背部皮膚中均有表達，相對分子量大小分別為28，23，21 ku。Image J軟件的分析結果表明，F(xiàn)GF7在E14d表達量最高，在E17d表達量最低（圖5-A）；FGF7蛋白在E13d，E14d，E15d和E16d的表達量分別是E17d的1.14倍（P＜0.001），1.20 倍（P＜0.001），1.17 倍（P＜0.001），1.06倍（P＜0.01，圖 5-B）。FGF10在 E15d表達量最高，在E13d表達量最低（圖5-A）；FGF10蛋白在E14d，E15d，E16d和 E17d的表達量分別是 E13d 的3.11 倍（P＜0.001），3.57 倍（P＜0.001），3.04 倍（P＜0.001），2.65倍（P＜0.001，圖 5-C）。FGF22 在 E17d表達量最高，在E14d表達量最低（圖5-A）；FGF22蛋白在E13d，E15d，E16d和E17d的表達量分別是E14d的 1.04倍（P＞0.05），1.55倍（P＜0.001），1.72倍（P＜0.001）和 1.79 倍（P＜0.001，圖 5-D）。

3 討論

毛囊是一種通過組織生長和重塑循環(huán)產生毛發(fā)的動態(tài)結構，由表皮和真皮2個部分組成[16]，最初是由包圍真皮下面一小簇細胞的表面外胚層向下生長而形成。毛囊的形成分為感應誘導、器官發(fā)生、細胞分化3個過程，可細分為8個階段。

FGF7由皮膚中的間充質細胞（如成纖維細胞/纖維細胞）合成和分泌，并由163個氨基酸編碼的糖蛋白組成。同時，F(xiàn)GF7充當上皮細胞增殖的旁分泌介質，刺激上皮細胞的遷移、擴散和增殖[17-18]。免疫組織化學和Western blot試驗結果顯示，F(xiàn)GF7在E14d的表達量最高。結果表明，F(xiàn)GF7在小鼠胚胎期第14天起主要作用。在毛胚細胞、毛釘、球根狀毛釘、表皮和真皮細胞中檢測到FGF7的表達。毛囊在胚胎階段的第14天開始形成，此時毛胚的表皮增厚由基底層中的柵欄狀樣的角質形成細胞組成。表皮基底層的角質形成細胞稱為毛胚細胞。毛囊形成的特征是真皮成纖維細胞數(shù)量的局部增加，臨近于毛胚沉積的表皮增厚[1-2]。研究表明，F(xiàn)GF7在毛囊形成中起重要作用。SCHMID等[19]研究表明，F(xiàn)GF7是一種真皮乳頭信號，參與指導毛胚細胞增殖。此外，PETIOT等[20]研究也證明，在小鼠模型試驗中，敲除FGF7的受體FGFR2 IIIb導致小鼠的毛囊密度降低和毛囊發(fā)育遲緩。結合本試驗結果可知，F(xiàn)GF7在毛囊形成中有重要作用，在毛囊形成的啟動階段，可能參與指導毛胚細胞的增殖。

FGF10也稱為角質形成細胞生長因子2，其以旁分泌形式介導間充質和上皮細胞信號轉導，在多個器官中起重要作用[21]。免疫組織化學和Western blot試驗結果顯示，F(xiàn)GF10在E15d的表達量最高。結果表明，F(xiàn)GF10在毛囊發(fā)育的第15天起主要作用，在毛胚細胞、毛釘、球根狀毛釘、表皮和真皮細胞中檢測到FGF10的表達。毛胚細胞下陷到真皮中，在E15d和E16d形成毛釘和球根狀毛釘，毛胚突起增多，表皮角質形成細胞變長變寬。毛胚細胞呈現(xiàn)出前后極向（毛胚近端朝向頭部，遠端朝向尾部）[1-2]。研究表明，F(xiàn)GF10在毛釘和球根狀毛發(fā)釘?shù)男纬芍衅鹬匾饔谩Ｔ谝阎腇GF家族成員中，F(xiàn)GF10與FGF7具有功能相似性[22]，其中，F(xiàn)GF10在毛囊形成中有重要作用，在毛囊形成的關鍵階段，可能參與指導毛釘和球根狀毛發(fā)釘?shù)男纬伞?/p>

FGF22是FGF7亞家族的另一成員，其與FGF7和FGF10密切相關。免疫組織化學和Western blot試驗結果顯示，F(xiàn)GF22在E17d的表達量最高。結果表明，F(xiàn)GF22在毛囊發(fā)育的第17天起主要作用，在毛胚細胞、毛釘、球根狀毛釘、表皮和真皮細胞中檢測到FGF22表達；在第17天時毛囊初步形成，毛釘已經(jīng)變得高度伸長并且顯示出早期毛囊的第一特征：在毛釘尾部的細胞呈現(xiàn)燈泡狀增厚，形成一個突出的寬的真皮乳頭腔；此時，內根鞘的上皮層或Henle層在真皮乳頭上方形成錐形結構[1-2]。研究表明，F(xiàn)GF22在毛釘成熟中起重要作用。具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）結合位點和CCAAT盒的FGF7啟動子和具有雙bHLH結合位點的FGF10啟動子較為保守，而FGF22啟動子則不同[14]。結果顯示，F(xiàn)GF22在毛囊中的功能不同于FGF7和FGF10。推測FGF22在毛囊形成和成熟中起重要作用，在毛囊基本形成階段，可能促進毛釘成熟。

4 結論

本研究表明，在胚胎期小鼠皮膚組織中，F(xiàn)GF7（FGF7/FGF10/FGF22）亞家族主要在毛胚細胞、毛釘、球根狀毛釘、表皮和真皮細胞中表達。FGF7亞家族3個成員在胚胎小鼠毛囊形成中均可發(fā)揮重要作用，其中，F(xiàn)GF7在毛囊形成的啟動階段即胚胎期第14天發(fā)揮主要作用，可能參與指導毛胚細胞的增殖；FGF10在毛囊形成的關鍵階段即胚胎期第15天發(fā)揮主要作用，可能參與指導毛釘和球根狀毛發(fā)釘?shù)男纬桑籉GF22在毛囊的基本形成階段即胚胎期第17天發(fā)揮主要作用，可能促進毛釘成熟。