骨肉瘤多藥耐藥性相關機制研究進展△

丁萬軍，曾濤綜述，戈偉審校

1武漢大學人民醫院腫瘤中心，武漢 430060

2武漢大學人民醫院東院內分泌科，武漢 430000

骨肉瘤是兒童和青少年較常見的一種惡性骨腫瘤，其主要發病部位為股骨遠端和脛骨近端，多數患者在15～19歲發病[1]。截肢術曾是骨肉瘤的標準治療術式，但患者術后5年的生存率不足20%[2]。隨著腫瘤化療技術的不斷發展，化療聯合保肢手術成為臨床治療骨肉瘤的重要手段，可使患者的5年生存率提高至66%～82%[3-4]。然而部分骨肉瘤患者因多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）而對化療不敏感，從而導致治療失敗，這也是影響骨肉瘤患者預后的主要原因之一[5]。MDR是指對一種化療藥物具有耐藥性的同時，對其他性質不同、作用機制不同的腫瘤化療藥物也具有耐藥性[6]。MDR可導致新輔助化療失敗或晚期挽救性化療失敗，最終導致骨肉瘤患者因腫瘤復發或廣泛轉移而死亡。

在過去的30年間，骨肉瘤的整體治療效果停滯不前，其主要原因為骨肉瘤的化療療效無明顯提高。MDR是骨肉瘤化療面臨的主要難題，也是骨肉瘤患者治療成功與否的重要因素[5]。因此，迫切需要進一步全面了解骨肉瘤的MDR機制，尋找新的逆轉MDR的治療方案，以進一步改善患者的預后。目前研究表明，MDR的發生與多種機制有關，如藥物排出增加、細胞解毒作用增強、細胞凋亡抑制、DNA損傷修復增強、骨肉瘤干細胞相關化療耐藥、自噬相關化療抵抗、長鏈非編碼RNA異常。本文將針對以上7個方面對骨肉瘤化療MDR機制的相關研究作一綜述。

1 藥物排出增加

1.1 三磷酸腺苷結合盒誘導的腫瘤MDR

腫瘤的MDR機制研究較早，其中了解最清楚的是P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的藥物泵作用。1976年，Juliano和Ling[7]首先在對秋水仙堿耐藥的中國倉鼠卵巢細胞中發現起藥物泵作用的P-gp是導致耐藥的主要因素，并由此提出了跨膜運輸理論。隨后，Kartner等[8]于1985年克隆出編碼P-gp的多藥耐藥基因1（multi-drug resistance gene 1，MDR1）。之后研究證實，P-gp在包括骨肉瘤在內的多種人類惡性腫瘤的MDR中具有重要意義。藥物泵作用導致的MDR理論被稱為經典MDR。

P-gp是三磷酸腺苷結合盒（adenosine triphosphate binding cassette，ABC）轉運蛋白超家族成員，由MDR1基因編碼。ABC轉運蛋白超家族成員包括P-gp、多藥耐藥相關蛋白1（multidrug resistanceassociated protein 1，MRP1/ABCC1）、多藥耐藥相關蛋 白2（multidrugresistance-associated protein 2，MRP2/ABCC2）及乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP/ABCG2）。P-gp是ABC轉運蛋白超家族中發現最早的一種蛋白，也是目前研究最廣泛和最深入的蛋白。P-gp為廣譜藥物外排泵，可以通過促進化療藥物的外排，增強腫瘤的化療抵抗能力。通過細胞膜上的藥物泵P-gp非特異性地將化療藥物排出是多種腫瘤細胞內藥物積聚減少的機制之一[9-10]。相關研究發現，P-gp的高表達與人類骨肉瘤細胞系的MDR相關[11-13]。一項對26例骨肉瘤患者的回顧性研究表明，核因子-κB（nuclear factor of kappa B，NF-κB）及P-gp過表達與骨肉瘤的化療耐藥有關[14]；而另一項對60例骨肉瘤患者的臨床試驗發現，ABCC2與化療反應有關[15]。此外，還研究表明，P-gp過表達與腫瘤進展有關，P-gp過表達骨肉瘤患者的腫瘤復發率和轉移率均較P-gp低表達骨肉瘤患者明顯增高[14,16-17]。

相關研究表明，ABC轉運蛋白超家族中的其他成員，如多藥耐藥相關蛋白（multidrug resistance protein，MRP）、BCRP等同樣也參與了腫瘤細胞耐藥的過程[12-13]。Chen等[3]研究發現了MRP1在線粒體膜上的表達及其外排活性。

1.2 還原的葉酸載體誘導的MDR

除了增加化療藥物的細胞外排，減少化療藥物的細胞內流入也是導致骨肉瘤耐藥的重要機制之一。甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）是骨肉瘤的常用化療藥物之一，該類藥物進入細胞時需要經過細胞膜上還原葉酸載體蛋白（reduced folate carrier，RFC）的載運。當細胞膜上RFC的表達水平降低時，細胞內MTX的濃度也隨之降低，表明細胞膜上RFC的表達水平降低與MTX耐藥有關。Matherly等[18]對人骨肉瘤活檢樣本進行研究發現，與RFC表達水平高的骨肉瘤患者相比，RFC表達水平低的骨肉瘤患者對化療的敏感度較低。

2 細胞解毒作用

腫瘤細胞的耐藥還與細胞的解毒功能有關。關于細胞的解毒功能，目前研究最多的是谷胱甘肽S-轉移酶（glutathione S-transferase，GST）。GST的解毒作用是腫瘤細胞產生MDR的重要機制之一。GST是同源二聚體酶超基因家族成員，有θ、μ、α、π等多種同工酶，其N端谷胱甘肽（glutathione，GSH）的結合位點含有酪氨酸殘基，酪氨酸殘基羥基可以與硫醇化GSH形成氫鍵，在催化反應中有重要作用；其C端為親電子結合區，為底物結合位點[19]。GST-π與人類腫瘤耐藥的關系最密切，GST-π可以催化GSH的巰基，使其能與多種體內或體外來源的親電化合物結合形成極性較大的復合物，而該類復合物可以被MRP、P-gp等泵出體外，從而實現GST-π的解毒作用。但同時，大多數化療藥物也可以被GST-π催化，與GSH結合形成GSH-藥物復合物而被MRP泵出體外，從而使抗腫瘤藥物在體內的作用時間縮短，不能夠有效發揮抗腫瘤作用，導致臨床上發生嚴重的腫瘤細胞MDR[20]。GST-π不僅可以通過直接影響腫瘤細胞的解毒功能，還可以通過抑制絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activation protein kinase，MARK）通路來抑制腫瘤細胞凋亡，最終導致腫瘤細胞耐藥[21]。

相關研究表明，上調谷胱甘肽S-轉移酶P1（glutathione S-transferase P1，GSTP1）的表達，激活胞外信號調節激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）及抑制c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）的磷酸化，均能夠降低骨肉瘤細胞對多柔比星和順鉑的化療敏感度[22]。還有研究發現，GSTP1過表達骨肉瘤患者的術前化療療效較GSTP1低表達患者差[23]。Townsend和Tew[21]研究發現，化療可以誘導GSTP1蛋白表達上調，而GSTP1高表達與骨肉瘤患者的預后不良有關。

3 細胞凋亡抑制

誘導細胞凋亡是化療藥物根除腫瘤細胞的主要機制之一，因此細胞凋亡的異常改變是MDR的重要機制。

3.1 Bcl- 2基因及其表達產物

Bcl-2基因是與細胞凋亡關系密切的原癌基因之一，主要編碼抗凋亡蛋白[如B細胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma/leukemia 2，Bcl-2）、B 細胞淋巴瘤/白血病-xL（B-cell lymphoma/leukemia xL，BclxL）]和促凋亡蛋白[如Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，BAX）、Bcl-2拮抗物（Bcl-2 antagonist/killer，BAK）、Bcl-xL/Bcl-2相關死亡啟動因子（Bcl-xL/Bcl-2 associateddeath promoter，BAD）]，其中與骨肉瘤化療耐藥相關的產物為Bcl-2蛋白和BAX蛋白，兩種蛋白的作用相反，分別通過抑制或促進線粒體釋放細胞色素C來調控細胞凋亡。目前，關于Bcl-2蛋白和BAX蛋白對骨肉瘤化療敏感性的作用仍存在爭議。但有研究認為，BAX/Bcl-2蛋白表達率增高與骨肉瘤患者的4年生存率和無瘤生存率降低有關[24]，表明Bcl-2蛋白介導的細胞凋亡可能與骨肉瘤患者的總生存有關；另外，Bcl-2蛋白活性可能與骨肉瘤的組織學惡性程度有關，Bcl-2蛋白活性越高，骨肉瘤的組織學惡性程度越高。Bcl-2的表達也被證明與骨肉瘤患者的預后密切相關[25]。

3.2 p53基因

p53基因是一種抑癌基因，是細胞生長、增殖的負調節因子，對細胞周期及細胞凋亡的調控起關鍵作用。突變型p53基因失去了對細胞增殖的監控作用，反而可以促進細胞的增殖、轉化及癌變[26]。既往研究顯示，p53基因突變可能與骨肉瘤細胞MDR相關。如孫麗梅等[27]在對260例原發性乳腺癌患者手術切除標本的研究中發現，突變型p53蛋白的陽性表達與GST-π的陽性表達呈正相關，提示突變型p53蛋白可能通過促進GST-π蛋白的表達，導致乳腺癌MDR。Tsuchiya等[28]對骨肉瘤細胞系的研究發現，轉染野生型p53基因的骨肉瘤細胞對順鉑的敏感度較轉染突變型p53基因的骨肉瘤細胞提高2倍。有研究表明，p53基因突變的骨肉瘤患者的術前化療敏感性差于p53基因未突變的患者；同樣，也有一些研究表明，p53突變型骨肉瘤患者的總生存情況較對照組患者差，表明p53表達可能是骨肉瘤患者的預后因素[29-30]。另外，Wunder等[31]研究發現，與p53低表達組比較，p53過度表達組骨肉瘤患者的化療后組織學反應差（≤90%壞死）。此外，還有研究表明，在骨肉瘤中p53基因突變可能與MDR1基因表達增加有關，后者可以促進P-gp的表達，最終導致患者預后不良[32]。

3.3 微小RNA

微小RNA（micro RNA，miRNA）是一系列進化保守內源性非編碼RNA，是由20～25個核苷酸組成的單鏈RNA分子。miRNA與靶基因信使RNA（messenger RNA，mRNA）的不完全互補配對，可以負性調控靶基因的表達，抑制靶基因編碼的蛋白質的翻譯表達過程，促使mRNA降解。與編碼基因相比，miRNA更加穩定，而且單個miRNA可以同時調控多個蛋白質編碼基因及多條腫瘤相關的分子通路，因而miRNA調控機制復雜而多樣化。多項研究表明，miRNA與腫瘤的發生、發展及耐藥緊密相關[33-35]。因此，miRNA將可能作為預測腫瘤患者化療敏感性的生物標志物，并可能成為逆轉腫瘤MDR的靶點之一。

相關研究表明，miRNA-140可以通過抑制組蛋白脫乙酰酶4（histone deacetylase 4，HDAC4）使骨肉瘤細胞的G1期和G2期阻滯，從而抑制骨肉瘤細胞增殖，導致化療耐藥[33]。Song等[34]研究表明，miRNA-215可以通過抑制DTL蛋白的表達，使人骨肉瘤細胞阻滯于G2期，抑制人骨肉瘤細胞的增殖，增強人骨肉瘤細胞對MTX和雷替曲塞（TDX）的耐藥性。關于骨肉瘤的研究表明，miRNA-30a在對多柔比星耐藥的骨肉瘤細胞中呈低表達；而下調miRNA-30a表達則可以激活Bcl-1基因，誘導細胞自噬，從而促進骨肉瘤細胞對多柔比星耐藥[35]。

4 DNA損傷修復

治療骨肉瘤的化療藥物包括環磷酰胺和順鉑，該兩種藥物可以引起DNA損傷，從而導致細胞死亡。因此，MDR相關的機制之一為骨肉瘤細胞DNA損傷修復能力的增強。一般情況下，細胞主要通過以下4種機制對DNA損傷進行修復：堿基切除修復（base excision repair，BER）、雙鍵斷裂修復（double strand break repair，DSBR）、錯配修復（mismatch repair，MMR）、核苷酸切除修復（nucleotide excision repair，NER）[36]。BER、NER 和 DSBR功能的異常增強與抗腫瘤藥物耐藥性呈正相關，MMR則對抗腫瘤藥物耐藥起負向調控的作用，提示DNA修復功能異常與腫瘤耐藥之間的關系十分復雜[37]。

作為DNA損傷修復的主要途徑之一，BER催化的底物范圍非常廣泛（如烷化劑、電離輻射和類輻射藥物等導致的單鏈斷裂以及鉑類藥物等形成的單功能DNA加合物等），因此BER功能異常與抗腫瘤藥物耐藥關系密切。李曉等[38]研究發現，ERCC2、ERCC4基因與骨肉瘤患者化療的組織學反應有關。同樣，另一項研究顯示，ERCC2的基因多態性與骨肉瘤患者治療過程中對順鉑的敏感性有關，并且還與患者的總生存情況有關[39]。Biason等[40]研究發現，ERCC2的基因多態性與骨肉瘤患者的無事件生存率呈正相關，等位基因rs1799793和ERCC2可以作為預測骨肉瘤患者順鉑敏感性的標志物。隨后相關研究證實，在中國人群中，ERCC2的基因多態性與骨肉瘤患者對順鉑的敏感性呈正相關[41]。此外，一項關于858例骨肉瘤患者的薈萃分析結果顯示，骨肉瘤患者中ERCC2Lys751Gln多態性與患者的總生存率有關，ERCC5his46his的突變與骨肉瘤患者的無事件生存率有關[42]。

5 骨肉瘤干細胞

盡管腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）假說最早在20世紀70年代已經提出了，但直到近幾年，干細胞生物學的研究才為這一假說提供了越來越多的實驗證據。目前認為，腫瘤內的一個小類具有自我更新與分化能力的細胞亞群細胞被稱為CSC，CSC與腫瘤的發生、轉移、治療抵抗和復發有關。已有研究發現，CSC可能參與腫瘤MDR機制[43]。

雖然CSC與骨肉瘤細胞耐藥性的具體作用機制仍未被清楚地闡明，但CSC介導骨肉瘤的MDR已被證實。CSC藥物外排系統增強時，某些ABC多藥物轉運蛋白（如P-gp）在CSC中的表達水平明顯增加。通過免疫熒光顯微鏡觀察發現，骨肉瘤干細胞中ABCG2的表達水平明顯高于腫瘤細胞，其外排藥物的能力不受ABCB1抑制劑（維拉帕米）的影響[44]。化療藥物通常可以引起DNA損傷或干擾細胞代謝，當DNA損傷嚴重或DNA修復不足時，可導致細胞凋亡。因此，CSC DNA修復效率的提高可以導致化療耐藥。在對骨肉瘤干細胞的研究中發現，骨肉瘤干細胞中DNA修復基因（MLH1和MSH2）的表達明顯上調[45]。干細胞具備的解毒機制在骨肉瘤耐藥中也起到了一定作用。相關研究表明，在骨肉瘤干細胞中乙醛脫氫酶-1的解毒作用明顯強于骨肉瘤細胞[46]。骨肉瘤干細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2、IAP-1、IAP-2及survivin的表達水平較骨肉瘤細胞明顯增加，抗凋亡能力較骨肉瘤細胞明顯增強[47]。骨肉瘤干細胞也可以通過p53和RB途徑逃避衰老和凋亡，從而抵抗化療的作用。劉蓋為等[48]研究發現，對順鉑耐藥的骨肉瘤細胞干細胞特性增強，而Notch信號通路激活可能是導致其干細胞特性增強和細胞耐藥的主要原因。

6 自噬相關化療抵抗

Autophagy是希臘術語中“自我吞噬”之意，又稱Ⅱ型程序性細胞凋亡，以電鏡下出現大量雙層膜的自噬體為特征，是指蛋白質轉換過程中起管家作用的物質允許細胞消除不需要的蛋白質或已損壞的細胞器。在饑餓、低氧及細胞毒性作用等壓力性環境下，細胞自噬作為能量來源，為機體提供氨基酸來維持細胞生存[49]，其對細胞存活、代謝及生長等不同生物學功能發揮了關鍵作用。自噬是一把雙刃劍，一方面，自噬可以幫助清除受損的細胞器和蛋白質從而促進腫瘤生長；另一方面，持續或過多的自噬促進了腫瘤細胞的程序性死亡。近年來，腫瘤細胞自噬和化療耐藥之間的關系成為研究的熱點。抑制腫瘤細胞自噬可以增強化療效果并促進腫瘤消退。

研究發現，在急性髓系白血病、肺癌、胃癌、食管癌、骨肉瘤、卵巢癌等多種人類腫瘤細胞中，自噬相關基因與MDR過程相關[50-51]。自噬的調控，在包括人類在內的哺乳動物細胞內主要是依賴雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，MTOR）途徑。Gazitt等[52]研究發現，在人類骨肉瘤的多種細胞系中，雷帕霉素及其他MTOR抑制劑能夠通過抑制細胞中MTOR信號通路的活性，調控細胞自噬，從而導致增殖期細胞數目減少，達到抑制骨肉瘤細胞生長目的。Xie等[53]研究發現，雷帕霉素能夠通過抑制人骨肉瘤MG63細胞的增殖，降低MG63細胞MTOR通路組件的磷酸化水平。同時，應用自噬抑制劑可以增強雷帕霉素誘導的MG63細胞凋亡作用。還有研究發現，熱休克蛋白90抑制劑具有抗腫瘤作用，其作用機制為抑制MTOR激活自噬，與自噬抑制劑聯合應用同樣能顯著提高骨肉瘤細胞的凋亡水平[54]。一項關于人骨肉瘤MG63細胞的對照研究發現，大劑量順鉑處理組MG63細胞的Beclin-1mRNA表達水平明顯高于低劑量順鉑處理組和非順鉑處理組，同時給予順鉑聯合自噬抑制劑可以明顯增加MG63細胞的增殖抑制率。該研究結果提示，大劑量順鉑可能通過過度激活骨肉瘤細胞的自噬導致耐藥[55]。此外，多種化療藥物可以誘導人骨肉瘤細胞中Beclin-1的表達上調，而敲除Beclin-1基因或使用自噬抑制劑時，骨肉瘤細胞對化療更為敏感。

miRNA可對細胞自噬進程起調控作用，其主要機制可能與miRNA調控藥物轉運相關基因表達有關。已有研究發現，對多柔比星耐藥的骨肉瘤細胞中miRNA-30a的表達明顯下調，自噬活性明顯增加[56]。

7 長鏈非編碼RNA功能失調相關耐藥

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是指無特定開放閱讀框，不編碼蛋白質的一類RNA分子，其核苷酸數目通常大于200。lncRNA可以通過多種方式改變細胞的耐藥性，如增加藥物代謝、增強藥物外排、細胞周期的改變、細胞凋亡異常、上皮-間質轉化等。Li等[57]研究發現，與正常組織相比，骨肉瘤組織中lncRNA HOTTIP（HOXA transcript at the distal tip）明顯呈高表達。用不同劑量的順鉑處理人骨肉瘤細胞后，細胞中HOTTIP表達水平增高，并通過激活Wnt/β-連環蛋白（β-catenin）途徑促進細胞進入S期，從而促進骨肉瘤細胞對順鉑耐藥。

Wang等[58]研究發現，大劑量順鉑處理骨肉瘤細胞后可使LINC00161表達水平明顯增高，促進骨肉瘤細胞凋亡；而在對順鉑耐藥的骨肉瘤MG63細胞中，LINC00161的表達水平明顯降低，此時若上調LINC00161的表達則可逆轉骨肉瘤MG63細胞對順鉑的耐藥性。Zhu等[59]研究發現，人骨肉瘤MG63/DXR細胞系中多種LncRNA表達異常，其中ODRUL、FOXC2-AS1表達水平明顯升高，NR-036444表達水平明顯降低。推測人骨肉瘤MG63/DXR細胞對多柔比星的敏感性可能與ODRUL、FOXC2-AS1調節MDR基因（包括ABCB1、HIF1A、FOXC2等）的表達有關。隨后，Zhang等[60]的細胞學研究證實，在體外骨肉瘤細胞中ODRUL通過促進ABCB1基因的表達，使P-gp表達水平增高，導致骨肉瘤細胞對多柔比星的耐藥性增加。Feldstein等[61]研究發現，抑制LncRNA XLOC006942（ERIC）的表達可以促進依托泊苷誘導的人骨肉瘤細胞凋亡，表明ERIC可能與骨肉瘤細胞對依托泊苷的敏感性有關。

8 小結與展望

通過對上述與骨肉瘤化療MDR發生的相關機制進行綜述，可以發現多種分子信號轉導通路在骨肉瘤化療MDR發生發展中起重要作用。學者應提高對信號轉導通路在骨肉瘤MDR發生中作用的認識，尋找更多MDR發生的相關信號通路，為后期開發出更多針對該相關信號通路的分子靶向藥物打下基礎。同時，骨肉瘤化療出現MDR為多因素綜合作用的結果，各因素之間可存在一定的交互作用，如非編碼RNA既可以調節耐藥基因的表達，也可以對細胞自噬產生影響。因此，針對傳統化療方案效果不佳的骨肉瘤患者，適時調整或整合針對上述耐藥機制的綜合治療方案有助于提高化療敏感性。目前有關骨肉瘤化療出現MDR的研究取得了長足進步，但在以下兩個方面仍存在不足：①目前臨床研究熱點多集中在研究與骨肉瘤化療敏感性有關的原發因素上，而針對MDR耐藥機制的治療措施研究鮮有報道；②由于骨肉瘤的發病率相對較低，目前多數研究集中在骨肉瘤細胞系的基礎之上，尚缺乏根據骨肉瘤患者血清或病理組織標本相關的實驗研究。針對上述不足，認為隨著互聯網醫療模式的發展，建立相應的骨肉瘤多中心信息共享機制勢在必行，同時應多學科合作，完善與骨肉瘤化療MDR相關機制的研究，使更多的新型化療藥物應用于臨床，進一步提 高骨肉瘤患者預后。