蛋白質組學技術及其在中醫藥治療骨質疏松癥研究的應用進展

白璧輝， 謝興文， 李鼎鵬， 黃晉， 徐世紅

（1.甘肅中醫藥大學，甘肅蘭州 730000；2.甘肅省中醫藥研究院，甘肅蘭州 730050；3.甘肅省中醫院，甘肅蘭州 730050）

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是以骨的含量減少、骨的微觀結構出現退化表現，致使增加了骨的脆性，導致易于發生骨折的一種全身性代謝疾病[1]。OP好發于中老年人。近年來，有關OP的防治更加規范細致，中西藥物治療能夠顯著增加患者的骨密度及骨強度，但不能使OP患者的骨重塑過程恢復平衡。新研發的促進骨合成的藥物在刺激新骨形成的同時也刺激了骨吸收，導致其療效并不穩定。而針對激素水平進行治療的藥物由于靶向性不強，難以進行根本性治療，且某些藥物的不良反應較多，甚至會出現安全性問題。目前OP治療存在的不足，凸顯開展OP早診斷、早預防的意義。利用蛋白質組學易感蛋白的定量技術，可以揭示OP每一階段的發生、發展的機理，特別是血清蛋白的表達改變，對于早診斷和早預防OP病變過程，具有重要的意義。中醫也逐漸將蛋白質組學技術應用于OP的探究中，以探索中醫OP證候分型與蛋白質的相關性以及中醫藥治療OP的蛋白質水平作用途徑。以下通過概述蛋白質組學在中醫藥治療OP的應用現狀，以期為中醫藥防治OP提供理論基礎。

1 蛋白質組學概述

蛋白質是生物生理功能的全面表達者，其結構和功能的研究能夠幫助研究者發現生命體在病理狀態下的發展規律并闡述其病變機理。對于研究OP者，蛋白質組學技術為一種非常有針對性的研究目標細胞和組織的工具[2]。目前生命科學的重點也已經轉移到了蛋白質的研究上。蛋白質能夠比基因更全面地反映生命體的功能及各種作用機制，而且蛋白質是細胞代謝最主要的執行者，同時也作為靶分子作用于多種致病因子。蛋白質組學技術可以直接分析生物樣本如血清、尿液、腦脊液等，能夠客觀準確地反映血清中絕大多數蛋白的含量[3]。隨著分子技術的蓬勃興起，蛋白質組學技術為尋找疾病的生物標志物提供了方向[4]。蛋白質組學可表達更全面的疾病信息，更加接近生命體本質的生理和病理狀態。通過蛋白質組學比較不同狀況下細胞或組織中蛋白質的數量及位置的差異，尋找疾病的特異蛋白質，可為疾病的發生機制與診斷提供不同的標識，為新藥研發提供指導。因而，蛋白質組學的研究有著廣泛的臨床及應用前景。

2 蛋白質組學常用技術

2.1蛋白質分離技術蛋白質的分離技術是蛋白質組學研究的重要部分，主要包括雙向凝膠電泳技術（2-DE）、雙向熒光差異凝膠電泳（2D-DIGE）技術、高效液相色譜技術（HPLC）、雙向HPLC（2D-HPLC）技術、親和層析、毛細管電泳等6種分離技術，可用來分析從細胞、體液或組織中提取的復雜的蛋白質混合物。根據蛋白質的特性，可分離數千種不同的蛋白質組成的復雜混合物，并可確定每種蛋白質的相對含量。經過分離蛋白質樣品后，可得到分子的等電點及含量兩方面的信息。

2.2蛋白質鑒定技術現在普遍應用的蛋白質鑒定技術為生物質譜分析技術，主要包括早期的基質輔助激光解吸離子化質譜（MALDI-MS）、電噴霧離子化質譜（ESI-MS）、表面增強激光解吸離子化質譜（SELDI-MS），以及后期改良的表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜（SELDI-TOF-MS）技術、同位素標記術和標簽技術（ICAT）、蛋白質芯片（protein chips）等。由于該類技術具有迅速、靈敏、準確以及高通量、自動化等優點，并能進行蛋白質序列分析和翻譯后修飾的分析（糖基化、磷酰化），現已成為蛋白質組學研究中分析與鑒定肽和蛋白的最重要的手段。

2.3生物信息學目前生物信息學已經成為蛋白質組學研究中重要構成部分，研究人員已經為此建立了多個用于蛋白質組學研究的數據庫，最常用的3種為SWISS-PROT、EMBL和GEO，其中SWISS-PROT是最大、種類最多的蛋白質組數據庫。研究者通過在蛋白質組學數據庫中尋找與對比，可更全面地獲取蛋白質的結構與功能，從而更系統高效地進行分析，起到對比鑒定的作用。

3 蛋白質組學技術在中醫藥治療OP中的應用

3.1單味中藥大量研究表明單味中藥對OP的治療具有良好的效果。用于治療OP的中藥主要包括杜仲、熟地黃、淫羊藿、仙茅、骨碎補等。目前已提取多種中藥的有效成分用于治療，但對于其機理的探討仍較為匱乏。對于單味中藥治療OP作用機理的蛋白質組學研究，曾建春等[5]分析了杜仲誘導MSCs向成骨細胞分化的調控機制，通過電泳分離得到641個蛋白點，并選取了其中的75個進行質譜分析，證明杜仲可通過6個功能蛋白調節成骨細胞的增殖與分化，從而達到治療OP的效果；薛黎明[6]運用蛋白質組學研究淫羊藿、仙茅單味藥防治OP的作用機理，結果顯示，淫羊藿中的總黃酮、仙茅中的苯甲酸酯類總酚苷能明顯改善OP導致的尿液和血液代謝產物的變化，并參與能量、氨基酸和脂肪的代謝以及氧化應激、細胞骨架形成，同時發現淫羊藿苷和仙茅苷及其配伍可改善成骨細胞和破骨細胞的線粒體膜電勢和三磷酸腺苷（ATP）含量。骨碎補主要通過調控骨代謝相關分子及骨形成蛋白通路上相應的靶點，發揮抑制骨吸收及促進骨形成的作用，最終達到治療OP的目的[7]。

3.2中藥復方治療OP的中藥復方主要包括左歸丸、六味地黃丸、獨活寄生湯、二仙湯等經典名方。相關的臨床實驗研究報道此類復方可通過促進骨骼礦化，維持骨代謝平衡，達到減輕臨床癥狀，提高治療效果的目的。盧嚴方等[8]運用蛋白質組學技術對美國國家生物信息中心（NCBI）中的GEO數據庫中六味地黃丸治療絕經期腎陰虛OP的相關信息進行檢索，發現六味地黃丸在治療腎陰虛型OP絕經期患者時，其基因TNP1和MAP3K10的表達明顯增加，而ZNF家族基因和XRN1、XPO1、NUP54等基因的表達顯著下降；故認為該復方通過促進雌激素表達及與其受體結合，保持免疫應答平衡而促進骨組織形成，從而達到改善骨代謝作用。而陳娟等[9]采用傳統的免疫組化研究，發現六味地黃丸治療腎陰虛型OP絕經期患者是通過調控JAK/STAT通路中IRF1基因信號干預免疫功能而實現的。以上文獻分析表明蛋白質組學技術比免疫組化方法的研究結果更加全面，并有助于進一步的探析。

對于二仙湯、左歸丸、壯骨止痛方作用機制的研究，劉志文等[10]研究二仙湯對去卵巢骨質疏松大鼠股骨蛋白質組的影響，檢測股骨組織蛋白，通過定量分析差異表達蛋白的強度，共發現41種差異表達蛋白（主要包括生物氧化相關蛋白、信號轉導途徑相關蛋白等），發現差異表達的蛋白質如碳酸酐酶2和整合素β1是二仙湯的作用靶點。張穎等[11]對去卵巢OP大鼠的雙側股骨骨髓進行蛋白質雙向電泳并對其電泳圖譜進行分析，篩選出與左歸丸療效的相關蛋白，并進行質譜分析，共篩選出23個差異蛋白點，鑒定出其中的11個蛋白質點，包括果糖酸縮酶A、抗氧化蛋白6、α烯醇化酶、烯醇化酶3、白蛋白、鈣網蛋白、蛋白二硫化物異構酶A3等；發現左歸丸通過調節含以上相關蛋白的細胞的增殖、分化、代謝、凋亡等來治療OP。楊軍等[12-13]對去卵巢大鼠OP模型股骨的蛋白質進行雙向電泳，獲得各組總蛋白質的圖譜，用圖像分析各組間差異蛋白質點并結合蛋白質生物信息庫（MLD），對各蛋白質進行鑒定，發現X1（胰島素受體蛋白）、X2（熱休克同源蛋白）、X3（分泌顆粒素Ⅱ）這3種差異蛋白在壯骨止痛方治療OP的過程中發揮著重要的調控作用。

3.3針刺治療針灸作為臨床上的常用治療方法，能夠從整體或多臟腑進行靶點性的全面治療，療效肯定并具有安全性高、成本低等優點，在治療OP方面具有一定的優勢。現代研究發現針灸治療OP能夠抑制破骨細胞關鍵調控因子OPG和RANKL mRNA表達，刺激成骨細胞特異基因CB1 mRNA表達，調節骨量平衡，同時通過提高Ⅰ型膠原氨基端延長肽水平及降低β-Ⅰ型膠原羧基端肽來改善臨床癥狀[14-15]。秦瑋等[16]采用蛋白質組學技術分析針刺命門穴治療絕經后OP的機制：以電針刺激去卵巢OP大鼠命門穴，觀察去卵巢OP大鼠下丘腦骨形態發生蛋白2（BMP-2）及其信號轉導蛋白Smad1/5表達的調節機制。實驗結束后，采用免疫組化法檢測下丘腦BMP-2及其信號轉導蛋白Smad1/5的表達。結果顯示實驗組下丘腦BMP-2及其信號轉導蛋白Smad1/5陽性細胞總面積、陽性細胞平均灰度值與兩個模型組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。以上結果不僅為針刺命門穴治療絕經后OP提供一定的理論依據，而且為運用蛋白質組學技術研究針刺治療OP的作用機制提供了思路與方法。

4 討論

關于OP發病機理，目前認為其機制與骨的抑制、吸收及骨形成之間的失衡有關，研究多集中在基因水平，如OPG/RANKL/RANK系統、Wnt/βcatenin 途徑、Cbfa1、Osterix、Runx、Cathepsin K等轉錄因子及酶的作用機制已經逐漸被揭示，但大多以單基因或小基因、單通路或小通路研究為主，未能從整體蛋白質水平去探索發病規律[17]。蛋白質組學的研究能直接反映1個基因組或者1種細胞/組織中攜帶的信息及所表達的全部蛋白質。蛋白質是完成生命活動的最終形式，能比基因更加真實全面地反映生物體的功能及各種作用機制[18-19]。中醫學相對于現代醫學雖然對疾病的微觀認識和處置方法有所不同，但中醫也逐漸將蛋白質組學方法應用于疾病的研究。采用蛋白質組學技術篩選和鑒定血清中OP狀態和正常生理狀態下的差異表達蛋白，將有利于OP的發生機理的闡明，為中醫藥早期診斷與及時治療OP提供理論基礎，并為后期研發針對OP人群的治療藥物提供依據。

目前針對中醫藥治療OP的蛋白質組學研究還比較少，且以在體動物和離體細胞實驗為主，文獻報道數量不多。隨著蛋白質組學技術的改進及其在OP防治領域的進一步應用，將會進一步發掘出與OP疾病相關的蛋白質。探究引起OP的蛋白質組成，揭示差異蛋白影響OP發生的機理，并利用蛋白質組學的現代化技術對中醫辨證分型進行探究，利用生物信息學資料比較分析實現微觀辨證分型，將對促進對OP早期診斷和預防、及時治療和中醫藥現代化具有重大意義。