細胞外囊泡在肝細胞癌及膽管癌診治中的作用研究進展

解飛虎，馮時，孫樂家，毛一雷

（中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院 肝臟外科，北京 100730）

細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是細胞旁分泌產生的亞細胞成分，由脂質雙分子層包裹形成球形囊泡，內含豐富的核酸、脂質、蛋白等，參與細胞間的物質交換和信息交流。依據(jù)其產生來源和生物學特點又分為外泌體、微囊泡和凋亡小體，其中關于外泌體的研究較為廣泛，微囊泡次之[1]。EVs最初被認為是細胞排泄代謝產物的一種細胞結構，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)EVs參與機體內眾多的生理、病理活動。近年來研究發(fā)現(xiàn)EVs是腫瘤細胞與靶細胞信息交流的重要方式，能通過調節(jié)腫瘤細胞的微環(huán)境，調控腫瘤細胞的增殖、轉移和浸潤能力[2-3]。EVs攜帶來源腫瘤細胞內特定的核酸、蛋白等分子物質，具有很強的腫瘤特異性，有望成為新型分子標志物用于良惡性疾病診斷和預后判斷等，其球形載體的特殊結構，同時也是良好的新藥研發(fā)工具[2-5]。肝細胞肝癌（hepatocellular cancer，HCC）是最常見的原發(fā)性肝腫瘤，因缺乏早期典型的臨床表現(xiàn)，很多肝癌患者在確診時已喪失根治性切除機會。對于晚期肝癌患者，介入栓塞、靶向治療以及化療等只能有限延長患者的生存期[6-7]。膽管癌（cholangiocarcinoma）約占消化道腫瘤的3%，同樣由于缺乏早期的臨床表現(xiàn)，膽管癌的早期診斷和根治性手術切除率亦較低[7-8]。新近研究發(fā)現(xiàn)EVs在肝細胞癌和膽管癌的發(fā)生發(fā)展中扮演十分關鍵的角色，在腫瘤的診斷和相關治療中具有巨大的臨床應用前景[1-3]。本文就EVs在肝細胞癌和膽管癌的診斷及治療中的研究進展做一綜述。

1 肝臟來源的EVs及其生理特點

肝臟是多細胞實質性臟器，由肝細胞、膽管細胞、肝星狀細胞、竇內皮細胞，和Kupffer細胞等免疫細胞組成[9]。肝臟發(fā)揮正常生理功能有賴于肝內細胞之間的物質交換和信息交流。除了自分泌、旁分泌和細胞間直接接觸等信息交流方式外，肝細胞來源的EVs是肝內信號轉導的重要載體。在體外實驗中，大多數(shù)上述肝內的細胞都可以分泌EVs。不同細胞分泌的EVs有著不同的功能，如來自肝細胞的EVs能調節(jié)自身的增殖，來自肝星狀細胞的EVs參與肝纖維化的形成[10]。在細胞受刺激或在疾病狀態(tài)下，肝細胞分泌的外泌體及微囊泡會發(fā)生明顯量和質的改變，囊泡內蛋白及核酸的構成也會發(fā)生改變[11]。

膽汁由肝細胞合成后流經膽道進行排泄，收集肝細胞、膽管細胞及各種免疫細胞分泌的EVs。膽汁中EVs中含有豐富的miRNA、Inc-RNA和蛋白等，參與膽道內正常微環(huán)境的調節(jié)[12]。Masyuk等[13]在研究膽汁中EVs生理特點時發(fā)現(xiàn)，膽汁EVs可粘附于膽管上皮細胞纖毛，通過降低磷酸化的ERK1/2的比例和促進miR-15a的表達，抑制膽管細胞的增殖。Wang等[14]發(fā)現(xiàn)雞膽汁EVs可促進CD4+和CD8+T細胞的增殖和肝內巨噬細胞的活化，參與免疫應答。Severino等[15]發(fā)現(xiàn)膽管癌及胰腺癌患者膽汁EVs濃度明顯升高，依據(jù)膽汁中EVs濃度鑒別良惡性膽道疾病及胰腺疾病具有非常好的靈敏度和特異性。

在肝硬化的發(fā)生過程中，肝星狀細胞是分泌大量不溶性膠原促進纖維化形成的主要效應細胞，肝星狀細胞的活化是肝硬化發(fā)生的核心環(huán)節(jié)。Chen等[16]發(fā)現(xiàn)在肝星狀細胞活化過程中，肝星狀細胞分泌的EVs中扭曲基因相關蛋白1（TWIST1）的含量明顯下降，降低了miR-214的表達，間接促進結締組織生長因子2（connective tissue growth factor 2，CCN2）的合成，而后者是CCN2依賴性纖維化過程的核心物質。Charrier等[17]發(fā)現(xiàn)活化后的肝星狀細胞可以將CCN2打包到EVs中，EVs將CCN2轉運至其他靜止期或活化后的肝星狀細胞，進一步促進肝纖維化發(fā)生。

2 EVs在肝細胞癌和膽管癌中的診斷價值

與非腫瘤細胞相比，腫瘤細胞分泌EVs的濃度及其內容物成分迥異。有學者在對卵巢癌和肺癌細胞EVs中的RNA成分進行研究時發(fā)現(xiàn)，其與非腫瘤細胞EVs中的miRNA種類明顯不同，可以作為卵巢癌及肺癌的診斷性的生物標志物[18-19]。另有研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者血清EVs濃度明顯升高，利用血清中多糖磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1（glypican-1，GPC-1）表達陽性的EVs可以準確的區(qū)分胰腺癌和良性胰腺病變，并且GPC-1陽性的EVs濃度和胰腺癌患者生存期相關[20]。

2.1 EVs在肝細胞癌中的診斷價值

肝細胞癌患者多無明顯的臨床表現(xiàn)，挖掘潛在的生物標志物一直是肝癌診療領域的一個重要議題。Valadi等[21]在2007年首次研究發(fā)現(xiàn)外泌體可攜帶mRNA和miRNA至其他細胞，并在靶細胞內表達出相應蛋白產物。而后大量的證據(jù)表明腫瘤細胞EVs包含多種類型的RNA，具有很好的腫瘤特異性，可以作為潛在的生物標志物[22-25]。

成熟EVs miRNA約占總EVs RNA的40%以上[3]。體外實驗中肝癌細胞來源的EVs包含多種miRNA，如miR-584，miR-517c，miR-378等[21]，動物實驗中肝癌細胞EVs miRNA包括miR-10b、miR-21和miR-718等[22]。Sohn等[23]研究發(fā)現(xiàn)與乙肝及肝硬化患者相比，肝癌患者血清多種EVs miRNA明顯升高，包括miR-18a，miR-221，miR-222和miR-224等，而miR-101，miR-106b，miR-122和miR-195則低于前兩者。Sugimachi等[24]研究發(fā)現(xiàn)，與肝移植術后無復發(fā)的肝癌患者相比，術后復發(fā)患者的血清EVs miR-718的表達明顯下降，mi-R718的下降水平與肝癌細胞的侵襲性相關。Wang等[25]研究發(fā)現(xiàn)肝癌患者的血清EVs miR-21的表達水平較健康人群及慢性乙型肝炎患者明顯升高，且miR-21的高表達和患者的肝硬化程度和腫瘤分期相關。

2.2 EVs在膽管癌中的診斷價值

Severino等[15]研究發(fā)現(xiàn)膽管癌和胰腺癌患者膽汁EVs濃度明顯升高，是膽管結石和慢性胰腺炎的患者膽汁EVs濃度的10倍左右，依據(jù)膽汁EVs濃度進行膽管癌與膽管結石、胰腺癌和慢性胰腺炎的診斷實驗，診斷準確性可達到100%。該研究結果提示依據(jù)膽汁EVs濃度進行良惡性膽道梗阻的診斷效能明顯優(yōu)于血清CA19-9。Arbelaiz等[26]研究發(fā)現(xiàn)膽管癌、原發(fā)性硬化性膽管炎及肝細胞癌患者血清EVs濃度無明顯差異，但EVs內包含的多種蛋白具有很高的診斷價值。與原發(fā)性硬化性膽管炎及肝細胞癌患者相比，膽管癌患者血清EVs C-反應蛋白、ficolin-2、纖維蛋白原γ鏈和血漿蛋白酶C1抑制劑等分泌水平更高，其中ficolin-2、血漿蛋白酶C1抑制劑等在早期膽管癌（I～II期）患者血清中明顯升高，具有比血清CA19-9更高的診斷價值。Li等[27]研究發(fā)現(xiàn)人膽汁中含有了豐富的miRNA，與原發(fā)性硬化性膽管炎、慢性胰腺炎等良性疾病相比，膽管癌患者膽汁EVs中多種RNA（miR-191，miR-486-3p，miR-1274b）表達上調，用于診斷膽管癌具有良好的靈敏度和特異性。

3 EVs在肝細胞癌和膽管癌中的治療價值

3.1 EVs在肝細胞癌中的治療價值

EVs可作為攜帶miRNA的載體，在肝細胞癌的基因靶向治療中有重要的潛在應用價值。Wei等[28]研究發(fā)現(xiàn)，Vps4A可通過抑制PI3K/Akt通路，促進肝癌細胞內抑癌性miRNA的累積，抑制肝細胞癌的發(fā)展。而在肝癌細胞內及其EVs中，Vps4A的表達水平很低，通過提高EVs Vps4A的表達有可能達到抗腫瘤的治療目的。Lou等[29]研究發(fā)現(xiàn)，用miR-122轉染脂肪間充質干細胞分泌的EVs，將轉染后的Evs添加到肝癌細胞培養(yǎng)基中，可以誘導肝癌細胞周期G0/G1停滯和細胞凋亡。在腫瘤內部注射轉染后的EVs，可以增強索拉菲尼的抗肝癌療效。

在一項小鼠肝癌模型的實驗中，研究者將體外培養(yǎng)的H22肝癌細胞置于甲氨蝶呤等化療藥物和紫外線照射下，細胞相繼發(fā)生死亡后獲得攜帶化療藥物的微囊泡。然后在培養(yǎng)基中分別直接應用游離的甲氨蝶呤和微囊泡攜帶的相同劑量的甲氨蝶呤分別造成了2%和23%的細胞死亡。攝取了“毒性”微囊泡后的腫瘤細胞會進一步分泌具有細胞毒性的囊泡，產生一種多米諾效應式的細胞殺傷作用。微囊泡攜帶的甲氨蝶呤在抑制腫瘤生長和延長小鼠生存時間上較游離甲氨蝶呤更為有效[30]。

3.2 EVs在膽管癌中的治療價值

Li等[31]研究發(fā)現(xiàn)膽管癌細胞內和細胞微環(huán)境中miR-195表達均下調，用miR-195轉染成纖維母細胞來源的EVs，轉染后的EVs被膽管癌細胞攝取后在腫瘤內富集，可以縮小腫瘤體積，并延長小鼠腫瘤模型的生存時間。

4 總結與展望

近十年來關于EVs的研究有了長足的進展，EVs能夠直接反應來源組織細胞的代謝狀態(tài)和生物學特性，能夠攜帶來源組織細胞內特定核酸、蛋白等物質，腫瘤特異性極強，有望成為全新的生物分子標志物用于疾病的診斷和預后判斷。EVs還可以通過調節(jié)免疫應答和攜帶核酸、蛋白質等物質至靶細胞、靶器官，起到殺傷腫瘤細胞的作用，可能成為新型的抗腫瘤治療方式。現(xiàn)階段尚有一些亟待解決的問題：EVs的合成、分泌、參與信息交流等過程的分子機制尚不明確；EVs的亞群的種類、特性需要更深入的研究；缺乏大量制備、分離、純化及保存EVs的標準方案、方法等。關于EVs在腫瘤的發(fā)病及診療中潛在應用價值的研究尚處于起始階段，相關研究有限，相信在不久的將來，EVs將在腫瘤早期診斷和治療具有廣闊前景。