高效液相色譜法測定大蒜愈傷組織中大蒜素的含量

劉蘭，陳雅楠，尚云濤，范寶莉*，王振英

(1.天津師范大學 生命科學學院，天津 300387；2.天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387；3.天津市水資源與水環境重點實驗室，天津 300387)

大蒜素是大蒜中重要的天然活性成分，具有促進消化，抑菌，增強機體免疫力等功效[1]。目前，大蒜素的生產主要依靠大蒜提取和化學合成。從大蒜中提取大蒜素易受大蒜種質退化、氣候、貯藏及價格等多種因素影響。化學合成則存在原料雜質多、產品純度低等問題[2]。植物愈傷組織培養技術不僅是保護植物種質資源的重要手段，還能夠高效、穩定地獲得植物次級代謝產物，并已在中藥資源領域獲得廣泛應用[3-6]。目前，對于大蒜愈傷組織的研究主要集中于大蒜脫毒快繁、種質資源研究及多倍體育種方面[7-9]。從大蒜愈傷組織中提取大蒜素不但可以作為大蒜素生產的重要補充，還能夠充分利用我國現有優質大蒜資源，具有十分廣闊的發展前景和實際應用價值。

大蒜中含硫化合物種類較多[10]，本研究利用高效液相色譜法對大蒜愈傷組織中的二烯丙基二硫進行分析檢測。該方法靈敏度高，重現性好，操作簡便，結果準確，為大蒜愈傷組織中大蒜素的提取提供一種分析檢測技術。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大蒜愈傷組織材料：寶坻大蒜鱗莖誘導生成愈傷組織，繼代1次后作為供試材料。

二烯丙基二硫標準品：Sigma試劑公司；甲醇(梯度級色譜純)：康科德公司；超純水(≥18.2 MΩ·cm)；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

1200型高效液相色譜儀(配有二元泵、在線真空脫氣系統、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器、Chem Station工作站)：美國Agilent公司；電子天平、水浴鍋、離心機。

1.3 色譜體系

色譜柱：Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，保護柱：Eclipse Plus C18Grd(4.6 mm×12.5 mm，5 μm)，柱溫35 ℃，流動相為甲醇∶水(含0.2% 甲酸，80∶20)，流速1.0 mL/min，二極管陣列檢測器檢測波長240 nm，進樣量50 μL。

1.4 標準溶液制備

精密稱取二烯丙基二硫標準品30.0 mg，溶于甲醇中定容至50 mL，再吸取上述混合溶液1 mL用甲醇定容至10 mL，梯度稀釋作為系列標準溶液。

1.5 樣品前處理

稱取約2.0 g愈傷組織加入提取液(磷酸緩沖液)研磨，定容至10 mL，吸取愈傷組織勻漿以12000 r/min離心3 min，取上清液，經0.45 μm微孔濾膜準備上機檢測。

2 結果與分析

2.1 HPLC分析檢測的建立

2.1.1 HPLC檢測二烯丙基二硫標準品色譜圖及樣品

根據1.3的HPLC色譜體系，測得標準品和樣品的色譜圖(見圖1和圖2)。實驗結果表明，標準品和樣品中的二烯丙基二硫保留時間一致，分離度較高，該方法可以準確完成對大蒜愈傷組織中二烯丙基二硫的高效分離及檢測。

2.1.2 標準曲線的繪制

根據1.4的方法，以濃度0.3，0.6，1.2，1.8，2.4，3.0，4.5 μg/mL為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，見圖3。

圖1 二烯丙基二硫標樣色譜圖Fig.1 Chromatogram of diallyl disulfide standard

圖2 大蒜愈傷組織樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of garlic callus sample

注：1為二烯丙基二硫。

圖3 二烯丙基二硫標準曲線Fig.3 Standard curve of diallyl disulfide

實驗結果表明，二烯丙基二硫濃度在0.30～4.57 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好，其線性方程為y=20.65x-1.48，相關系數R2=0.999，以3倍信噪比計算檢出限為0.028 μg/mL。

2.2 樣品前處理對愈傷組織提取大蒜素含量的影響

2.2.1 溫度對愈傷組織提取大蒜素含量的影響

不同提取溫度對大蒜素含量影響的實驗結果見圖4。

圖4 溫度對愈傷組織提取大蒜素的影響Fig.4 Effects of temperature on extraction of allicin in garlic callus

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，大蒜素含量呈先增加后減少的趨勢。當提取溫度為35 ℃時，大蒜素含量達到最高，約為27 μg/g。這可能是因為當提取溫度過低時，蒜氨酸酶的活性較低，蒜氨酸酶不能有效催化蒜氨酸生成大蒜素。隨著提取溫度的升高，蒜氨酸酶的活性逐漸增強，大蒜素含量顯著升高。但當提取溫度達到40 ℃時，蒜氨酸酶活性受到抑制，大蒜素含量則明顯降低。

2.2.2 料液比對愈傷組織提取大蒜素含量的影響

不同料液比對大蒜素含量影響的實驗結果見圖5。

圖5 料液比對愈傷組織提取大蒜素的影響Fig.5 Effects of material-liquid ratio on extraction of allicin in garlic callus

由圖5可知，料液比在1∶1～1∶3的范圍內，隨著料液比的增大，大蒜素含量增加，當料液比為1∶3時，大蒜素含量達到最高，約為29 μg/g。當料液為1∶4時，大蒜素含量又有所降低。總體上講，料液比對大蒜素含量有一定的影響。

2.2.3 孵育時間對愈傷組織提取大蒜素含量的影響

不同孵育時間對大蒜素含量影響的實驗結果見圖6。

圖6 孵育時間對愈傷組織提取大蒜素的影響Fig.6 Effects of time on extraction of allicin in garlic callus

由圖6可知，隨著孵育時間的延長，大蒜素含量先上升，達到最大值后開始下降并逐漸趨于平衡。當處理時間為15 min時，大蒜素含量達到最高，約為33 μg/g。這可能是因為孵育時間在15 min以內時，蒜氨酸在蒜氨酸酶的作用下，大量產生大蒜素，并充分向水相轉移。但當孵育時間過長時，大蒜素則可能轉化為其他副產物，造成其含量下降。

2.2.4 pH值對愈傷組織提取大蒜素含量的影響

不同提取液pH值對大蒜素含量影響的實驗結果見圖7。

圖7 pH值對愈傷組織提取大蒜素的影響Fig.7 Effects of pH values on extraction of allicin in garlic callus

由圖7可知，隨著提取液pH值的升高，大蒜素含量呈現先下降，后逐漸升高，再下降的趨勢。這可能原因是由于蒜氨酸酶在接近中性的提取液條件下活性較高，且大蒜素在堿性條件下穩定性較差。在酸性條件下隨著提取液pH值的升高，大蒜素的轉化動力增大，當提取液pH為7.0時，大蒜素含量達到最高，約為27 μg/g。隨著pH值繼續增大，大蒜素處于堿性環境，結構受到影響，含量降低。

2.3 精密度實驗

取繼代1次的大蒜愈傷組織樣品按1.5的方法進行前處理，按1.3的色譜分析體系上機進行5次平行測試，計算保留時間及峰面積相對標準偏差(RSD)，見表1。結果表明，該方法精密度良好，大蒜素保留時間RSD<1%，峰面積RSD<1%。

表1 精密度實驗結果Table 1 The results of accuracy experiment

2.4 重復性實驗

取繼代1次的大蒜愈傷組織樣品5份按1.5的方法進行前處理，按1.3的色譜分析體系上機測試，計算保留時間及峰面積相對標準偏差(RSD)，見表2。結果表明，該方法重復性良好，大蒜素保留時間RSD<1%，峰面積RSD<2%。

表2 重復性實驗結果Table 2 The results of repeatability experiment

2.5 穩定性實驗

取繼代1次的大蒜愈傷組織樣品按1.5的方法進行前處理，分別靜置0，2，4，8，12，24 h，按1.3的色譜分析體系上機測試，計算保留時間及峰面積相對標準偏差(RSD)，見表3。結果表明，該方法穩定性良好，大蒜素保留時間RSD<1%，峰面積RSD<3%。

表3 穩定性實驗結果Table 3 The results of stability experiment

2.6 回收率實驗

取繼代1次的大蒜愈傷組織樣品5份按1.5的方法進行前處理，添加一定量的大蒜素標準品，按1.3的色譜分析體系上機測試，計算回收率。結果表明，大蒜素回收率為95%～102%，加標回收率較理想，見表4。

表4 樣品加標回收率Table 4 Sample recovery rate

3 討論

目前，大蒜素的檢測方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、定硫法和紫外可見分光光度法等[11-14]。其中高效液相色譜法因重現性好、精密度高、操作便捷等優勢成為大蒜素檢測的重要技術手段。

研究表明，影響植物愈傷組織提取代謝產物效果的因素很多，主要包括提取溫度、料液比、孵育時間和提取液pH等。大蒜素是由蒜氨酸酶在一定條件下催化蒜氨酸產生的，而溫度和pH是影響酶活性的重要因素。研究表明，蒜氨酸酶在溫度33～35 ℃，pH 6.5～7.0范圍內具有較高的催化效率[15,16]。本研究發現，當提取溫度低于30 ℃或高于35 ℃及pH低于6.5時大蒜素提取效率明顯降低。當孵育時間過短時，蒜氨酸酶不能與蒜氨酸充分反應生成大蒜素。而孵育時間過長，大蒜素又可能進一步分解為其他化合物。

與傳統大蒜種植相比，愈傷組織具有誘導增殖快、生長周期短、結構疏松、纖維素含量低、易于破碎、細胞發育程度相近等特點。從大蒜愈傷組織中提取大蒜素有利于降低生產成本，擺脫季節、氣候、地域等因素對大蒜品質的影響，具有便于生產標準化及品質控制，易于基因表達調控等優勢。因此，將愈傷組織作為生物反應器生產大蒜素將有著較為廣闊的應用前景。

4 結論

本研究對大蒜愈傷組織中提取的大蒜素進行初步分析鑒定。在不同前處理提取條件下，大蒜素提取效果不同，結果表明：提取溫度為35 ℃，料液比為1∶3，孵育時間為15 min，提取液pH為7.0時大蒜素提取效果較好，并應用HPLC技術檢測大蒜愈傷組織中的大蒜素含量。該方法靈敏度高，分離效果好，操作簡便，效率高，精密度及重復性均較為理想，實驗成本低，環境好，可以鑒定并精確檢測出大蒜愈傷組織中的大蒜素含量。