低鹽油腐乳發酵過程中品質和揮發性風味的分析

魏冠棉，張軍偉，周鵬*

(1.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 食品安全國際合作聯合實驗室，江蘇 無錫 214122)

油腐乳是以大豆為原料經磨漿、制坯、培菌、發酵而制成的發酵豆制品[1]。油腐乳因其營養豐富、質地細膩、滋味鮮美和激發食欲等特點，成為深受云、貴地區人們喜愛的調味品和佐餐食品。食鹽在油腐乳生產過程中具有以下作用：通過滲透壓的作用降低油腐乳毛坯中的水分含量；為油腐乳提供咸味；抑制毛霉等有益微生物過度生長，尤其是抑制和防止雜菌和致病菌的生長；抑制后發酵過程中蛋白酶、脂肪酶等酶的活性，防止油腐乳的過度發酵而引起質量問題[2]。雖然鹽在油腐乳生產過程中具有調味、抑菌等積極作用，但是高鹽與成人的高血壓癥、中風、胃癌和腎病等疾病顯著相關[3]；此外，在發酵后期，油腐乳的鹽含量大于12 g/100 g腐乳，其過咸的口感大大地限制了消費者的選擇[4]。而過低的鹽含量則會導致腐乳的質地松散或腐敗變質，從而引起腐乳的安全問題[5]。因此，制作低鹽含量的油腐乳很有必要。

近年來對腐乳的風味研究越來越多，莊洋等[6-10]研究了不同的菌種和配料對腐乳的揮發性風味物質的影響不盡相同，但腐乳揮發性風味成分以酯類和醇類為主，其中酯類含量最多。雖然對腐乳風味的研究很多，但針對低鹽發酵對油腐乳風味影響的研究卻未見報道。

因此，本實驗通過低鹽發酵制備油腐乳，并對發酵過程中油腐乳的品質和揮發性風味進行分析，為低鹽油腐乳的生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

低鹽腐乳生產過程中的原輔料、半成品和成品：中國南方某腐乳生產企業；毛霉菌株：實驗室保存菌株；酚酞、氫氧化鈉、硝酸銀、硫氰酸鉀標準品、硫酸鐵銨、甲醛、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、硫酸、硫酸銅和硫酸鉀：國藥集團化學試劑(上海)有限公司。

1.2 儀器與設備

HYL-C3搖床 太倉市強樂實驗設備有限公司；DM2000生物顯微鏡 徠卡顯微系統有限公司；BGZ-246電熱恒溫烘箱 上海博迅實業有限公司；T10 basic分散機、IKA-RO10攪拌器 德國IKA儀器設備有限公司；S220 Seven Compact pH/離子計 梅特勒-托利多公司；X08A自動消化裝置和K1302自動定氮分析儀 上海晟聲自動化分析儀器有限公司；Trace 1300 GC-MS色譜儀 賽默飛世爾科技公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 油腐乳的制備與采集

大豆→浸泡→磨漿→豆漿→加入酸漿制備酸豆腐→切塊→白坯→接種毛霉→前發酵→毛坯→晾曬→鹽漬→腌制→裝瓶→后發酵→油腐乳。

在后發酵0，30，90天時，隨機收集不同鹽含量的油腐乳，11% SCF(對照組)、9% SCF、7% SCF和5%SCF各5瓶。

1.3.2 油腐乳理化指標的測定

油腐乳中的水分含量采用直接干燥法測定，參照GB 5009.3—2010；總酸含量采用酸堿滴定法測定，參照GB/T 12456—2008；氨基酸態氮含量采用甲醛值法測定，參照GB/T 5009.39—2003；水溶性蛋白的測定參照NY/T 1205—2006；氯化鈉含量采用間接沉淀法測定，參照GB/T 12457—2008。

1.3.3 油腐乳揮發性風味物質的測定

樣品的前處理：取3 g研磨均勻的樣品于頂空進樣瓶中，加入1 g氯化鈉、3 mL去離子水和25 μL內標物(100 mg/L苯甲酸乙酯)，混勻，密封。

固相微萃取程序：將樣品瓶置于60 ℃水浴中振蕩孵育10 min，頂空萃取20 min，萃取頭插入進樣口后解吸5 min。

氣相條件：DB-WAX(30.0 m×0.32 mm×0.25 μm)色譜柱；進樣口溫度240 ℃；升溫程序：初始爐溫為40 ℃(保持2 min)，以10 ℃/min升至185 ℃(保持1 min)，再以10 ℃/min升到240 ℃(保持8 min)；載氣為氦氣，流速為1.5 mL/min；進樣量1 μL。

質譜條件：電離方式為EI；離子源溫度為230 ℃；掃描范圍為33～440 m/z，掃描速率為0.2 s/scan；電子能量為70 eV。

2 結果與分析

2.1 低鹽油腐乳發酵過程中品質的變化

通過腐乳的成熟度判定腐乳成熟過程中品質的動態變化；腐乳成熟度的判斷標準包括水分、總酸、氨基酸態氮、水溶性蛋白和食鹽含量[11,12]。

2.1.1 低鹽油腐乳發酵過程中水分含量的變化

圖1 低鹽油腐乳后發酵過程中水分含量的變化Fig.1 Changes of water content in low-salt oily fermented bean curd during post-fermentation

由圖1可知，在低鹽油腐乳后發酵90天過程中水分含量變化不顯著，這是由于油腐乳的水分在晾曬和鹽漬過程中幾乎達到平衡。低鹽發酵油腐乳的水分含量均小于75%，即符合中華人民共和國國內貿易行業標準SB/T 10170-2007《腐乳》中腐乳成熟的理化要求。

2.1.2 低鹽油腐乳發酵過程中總酸含量的變化

腐乳的酸度主要由發酵過程中產生的有機酸、游離氨基酸、游離脂肪酸等形成。前發酵過程中，微生物分泌大量的糖化酶和脂肪酶，使白坯中的碳水化合物和脂肪分解成有機酸等；后發酵過程中，蛋白酶催化生成游離氨基酸。

圖2 低鹽油腐乳后發酵過程中總酸含量的變化Fig.2 Changes of total acid content in low-salt oily fermented bean curd during post-fermentation

由圖2可知，隨著后發酵時間的延長，總酸含量呈遞增趨勢。在后發酵30天過程中，5% SCF的總酸含量增長最為顯著，其總酸含量為2.29 g/100 g；7%和9% SCF的總酸增長速度次之，11% SCF的總酸增長最慢。在后發酵90天過程中，5% SCF的總酸含量趨于穩定，7% SCF的總酸含量增加至2.35 g/100 g，9%和11% SCF的總酸含量緩慢增長。低鹽發酵油腐乳的總酸含量均小于2.5 g/100 g，即符合中華人民共和國國內貿易行業標準SB/T 10170-2007《腐乳》中腐乳成熟的理化要求。由于低鹽油腐乳鹽含量降低，使得鹽對酶的抑制作用降低，從而易于油腐乳后發酵過程中水解反應的進行和有機酸、游離氨基酸、游離脂肪酸等的生成，因此低鹽油腐乳的總酸含量高于對照組(11% SCF)含量。

2.1.3 低鹽油腐乳發酵過程中氨基酸態氮含量的變化

氨基酸態氮是指以氨基酸形式存在的氮元素的含量，是判斷發酵產品發酵程度的特性指標。它是由原料中的蛋白質水解產生的；指標越高，則氨基酸含量越高，鮮味越好。

由圖3可知，隨著后發酵時間的延長，氨基態氮含量逐漸增加；低鹽油腐乳的氨基態氮含量增長速度大于對照組(11% SCF)的增長速度。由于油腐乳后發酵30天時，油腐乳中鹽含量較低，對酶的抑制作用相對較小，氨基態氮含量增長較快；此外，由于油腐乳中鹽含量的不同，酶解反應受到的抑制作用不同，故氨基態氮含量增長速度不一致。隨著發酵時間的延長，油腐乳中鹽含量逐漸升高且達到平衡，導致酶的活性不同程度地降低，從而使得氨基態氮含量增長速度降低。低鹽發酵油腐乳的氨基態氮含量均大于0.5 g/100 g，即符合中華人民共和國國內貿易行業標準SB/T 10170-2007《腐乳》中腐乳成熟的理化要求，表明降低鹽含量利于提高氨基酸態氮含量和加速油腐乳的成熟。

圖3 低鹽油腐乳后發酵過程中氨基酸態氮含量的變化Fig.3 Changes of amino nitrogen content in low-salt oily fermented bean curd during post-fermentqation

2.1.4 低鹽油腐乳發酵過程中水溶性蛋白含量的變化

水溶性蛋白質和氨基態氮是腐乳中重要的風味前體物質，與腐乳品質有著密切的關系。腐乳發酵過程中水溶性蛋白質和氨基態氮均為蛋白質水解程度的表征。

圖4 低鹽油腐乳后發酵過程中水溶性蛋白含量的變化Fig.4 Changes of water-soluble protein content in low-salt oily fermented bean curd during post-fermentation

由圖4可知，隨著后發酵時間的延長，水溶性蛋白含量逐漸增加，在后發酵90天時含量相近。由于油腐乳后發酵30天時，低鹽油腐乳中鹽含量較低，對蛋白酶的抑制作用相對較小，水溶性蛋白含量增長較快。隨著發酵時間的延長和蛋白水解反應的進行，水溶性蛋白含量趨于穩定。低鹽發酵油腐乳的水溶性蛋白含量均大于3.2 g/100 g，即符合中華人民共和國國內貿易行業標準SB/T 10170-2007《腐乳》中腐乳成熟的理化要求，表明降低鹽含量有利于提高水溶性蛋白含量和加速油腐乳的成熟。

2.1.5 低鹽油腐乳發酵過程中氯化鈉含量的變化

鹽在油腐乳發酵過程中的作用主要是：賦予油腐乳咸味；通過滲透壓的作用降低油腐乳中的水分含量；抑制后發酵過程中的酶活，防止過度發酵而引起質量的問題；抑制毛霉等有益微生物過度生長，尤其是抑制和防止雜菌和致病菌的生長。

由圖5可知，隨著后發酵時間的延長，鹽含量先略微升高后趨于穩定。鹽漬后毛坯的鹽含量為5.99 g/100 g，而腌制調料中鹽含量不同，使得毛坯和腌制調料的滲透壓不同，因此后發酵前期，毛坯吸收腌制調料中鹽的速度不一致。隨著后發酵時間的延長，滲透壓降低，油腐乳中鹽含量趨于穩定。

圖5 低鹽油腐乳后發酵過程中氯化鈉含量的變化Fig.5 Changes of sodium chloride content in low-salt oily fermented bean curd during post-fermentation

2.2 低鹽油腐乳揮發性風味含量的變化

表1 低鹽發酵油腐乳中的揮發性風味物質含量Table 1 Content of volatile flavor compounds in low-salt oily fermented bean curd

續 表

由表1可知，通過GC-MS 方法分離鑒定出低鹽發酵油腐乳中揮發性風味化合物77種：2種酚類、5種醛類、5種酮類、10種酸類、26種醇類、22種酯類和7種烷烴類；5種樣品揮發性風味物質種類相近，但含量有較大差異：酸豆腐中揮發性風味化合物含量為5542.44 μg/kg，其中醇類、酸類和酯類占的比例較大，分別為74.41%，9.02%，5.81%；低鹽油腐乳中揮發性風味物質含量顯著升高，11%，9%，7%，5% SCF揮發性風味物質含量依次為21224.68，26898.17，34899.71，33548.01 μg/kg，其中酯類、醇類和醛類占的比例較大，分別為35.91%～41.78%，33.73%～43.11%和11.46%～22.76%。

酯類大多數具有特殊香氣，賦予了腐乳香甜氣味[13]。乙酸乙酯、2-甲基丁基乙酸酯、辛酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、亞麻酸乙酯、苯乙酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、乙酸熏衣草酯、乙酸戊酯、乙酸異戊酯和乙酸芳樟酯賦予了油腐乳果香和花香；油酸乙酯、亞油酸乙酯和棕櫚酸乙酯賦予了油腐乳奶油香氣和酯香；水楊酸甲酯和棕櫚酸甲酯分別賦予了油腐乳草藥香氣和酯香[14]。油腐乳揮發性風味物質中乙酯類物質含量較高，這與生產過程中乙醇的加入相關；在油腐乳發酵過程中，脂肪酸分解為游離脂肪酸，在酶的催化作用下游離脂肪酸與乙醇發生酯化反應生成具有香氣的脂肪酸酯類物質。

油腐乳中酸類、醇類和醛類等揮發性風味物質與發酵過程中物質的分解代謝緊密相關。脂肪在油腐乳成熟過程中降解形成己酸、辛酸和油酸等游離脂肪酸，它們分別賦予了油腐乳奶油味、脂肪味和豬油氣味[15,16]；蛋白質在蛋白酶作用下水解成游離氨基酸，苯丙氨酸(Phe)在酶的作用下分解代謝成苯乙醇，它賦予了油腐乳花甜香[17,18]；蛋白質在蛋白酶作用下水解成游離氨基酸，苯丙氨酸(Phe)在酶的作用下分解代謝成苯甲醛，它賦予了油腐乳堅果味。

3 結論

通過對11%，9%，7%，5%食鹽添加量的油腐乳后發酵過程中的理化指標和揮發性風味物質的分析，確定低鹽發酵能夠提高油腐乳的品質和揮發性風味物質的含量。綜合油腐乳發酵過程中的理化指標和揮發性風味物質，7%和9%食鹽添加量可以用于油腐乳的實際生產。