川西彝族傳統(tǒng)酸菜汁中乳酸菌的分離 鑒定與特性分析

袁樂梅，邊名鴻，李正濤，楊志陽，張雨

(1.四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000；2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川 自貢 643000)

酸菜是我國人民喜愛的傳統(tǒng)蔬菜發(fā)酵制品，其口味多樣、味道酸爽、開胃醒酒，不僅能幫助消化、增進食欲，還具有降低膽固醇和抗癌等功效[1]。酸菜汁液中含有多種功能性微生物，賦予了酸菜多種口感、營養(yǎng)和香氣[2]。不同地區(qū)的酸菜口味風(fēng)格相差較大，川西彝族傳統(tǒng)酸菜是在海拔1800 m的高寒地區(qū)制作出的特色酸菜，最終成菜是干酸菜，需煮食[3]。川西彝族傳統(tǒng)酸菜以圓根菜為主要原料，泡制過程中不添加鹽，避免了細胞因滲透壓過高而失水，發(fā)酵過程中也幾乎不產(chǎn)生亞硝酸鹽。由于其特殊的地理環(huán)境和獨特的制作工藝，形成了川西彝族傳統(tǒng)酸菜獨特的口感和香氣，同時其酸菜母汁中也富集了彝族高山地區(qū)特有的菌群，對其進行深入的研究并且應(yīng)用于蔬菜發(fā)酵中，對提高人們的健康水平和開發(fā)新的發(fā)酵蔬菜品種有著重要的意義[4]。

川西彝族傳統(tǒng)酸菜制作過程獨特，在沒有鹽脅迫的環(huán)境中乳酸菌仍富集為優(yōu)勢菌，說明該菌群的繁殖能力及抑菌能力都較強。本研究擬從川西彝族傳統(tǒng)酸菜汁中篩選抑菌性較強的乳酸菌，并對篩選得到的菌種進行鑒定及特性研究，以期將川西彝族傳統(tǒng)酸菜汁中的功能性微生物應(yīng)用于低鹽發(fā)酵蔬菜制品生產(chǎn)，為低鹽蔬菜發(fā)酵提供一定的菌種資源和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品：川西彝族傳統(tǒng)酸菜汁，采自川西傳統(tǒng)彝族家庭。

試驗菌株：大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，由釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室提供。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

PCR引物、Taq酶、10×緩沖液、dNTP：寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖：北京索萊寶科技有限公司；Marker：上海英駿生物技術(shù)有限公司；其他試劑：均為分析純，購于成都市科龍化工試劑廠。

MRS分離培養(yǎng)基[5]：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，檸檬酸氫二銨2 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，乙酸鈉5 g，吐溫-80 1 mL，碳酸鈣20 g，瓊脂20 g，加水定容至1000 mL，pH 6.2±0.2，滅菌待用。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[6]：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，加水定容至1000 mL，pH 7.5左右，滅菌待用。

1.3 儀器與設(shè)備

PHS-2C精密pH計 上海虹益儀器儀表有限公司；WH-2微型旋渦混合儀 上海瀘西分析儀器廠有限公司；生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；756紫外可見分光光度計 上海奧譜勒儀器有限公司；DYY-12電泳儀 北京百晶生物技術(shù)有限公司；PCR儀和凝膠成像系統(tǒng) 美國Thermo公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 產(chǎn)酸乳酸菌的分離純化

吸取1 mL彝族傳統(tǒng)酸菜汁，用無菌水將其進行逐級稀釋，制備10-1～10-99個梯度稀釋液。吸取各梯度的菌懸液200 μL涂布于MRS分離培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h。挑取具有較大溶鈣圈的菌落，再在MRS分離培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，按溶鈣圈大小分類并做好標(biāo)記[7]。

1.4.2 復(fù)篩

將溶鈣圈大的乳酸菌以2%的接種量，分別接種到含有MRS液體培養(yǎng)基的離心管中，置于搖床中，37 ℃下培養(yǎng)24 h，12000 r/min離心8 min，取上清液備用。以生理鹽水代替待檢上清液為對照組，用牛津杯雙層平板擴散法測定對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果[8,9]。量取抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈直徑大小進行復(fù)篩。

1.4.3 生長曲線和產(chǎn)酸特性分析[10]

以2%的接種量將復(fù)篩的乳酸菌接種于100 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃生化箱中培養(yǎng)24 h，每隔2 h吸取菌液在600 nm處測定吸光值和pH值。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以A600為縱坐標(biāo)繪制生長曲線圖；以pH值為縱坐標(biāo)繪制產(chǎn)酸能力曲線圖。

1.4.4 耐受性實驗

1.4.4.1 溫度耐受性

以2%的接種量將菌液接種于含有10 mL MRS液體培養(yǎng)基的試管中，分別于溫度25，27，29，31，33，35，37，39 ℃下培養(yǎng)24 h，每4 h在600 nm處測定吸光值，每組3個平行[11]。

1.4.4.2 pH耐受性

以2%的接種量將菌液接種于pH分別為2，3，4，5，6的含10 mL MRS液體培養(yǎng)基的試管中，于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別在600 nm處測定吸光值，各pH下的菌株做3組平行[12]。

1.4.4.3 鹽度耐受性

以2%的接種量將菌液接種于NaCl質(zhì)量濃度分別為0，4%，8%，12%，16%，20%，24%的含10 mL MRS液體培養(yǎng)基的試管中，于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每隔4 h分別在600 nm處測定吸光值，各NaCl質(zhì)量濃度下的菌株做3組平行[13,14]。

1.4.5 乳酸菌16S rDNA分子生物學(xué)鑒定[15]

PCR引物的上游序列為27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，下游序列為1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

PCR反應(yīng)體系(50 μL):10×緩沖液5 μL，dNTP 3 μL，引物27F和1492R各1 μL，Taq酶1 μL，模板3 μL，DDW 36 μL。

PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)后，72 ℃保留10 min；于10 ℃保存。

PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察，可見約1500 bp條帶，送至上海生物生工測序有限公司成都分部進行測序，將測序結(jié)果輸入NCBI，利用數(shù)據(jù)庫中的BLAST功能與已有的細菌16S rRNA基因序列進行對比，選擇與測定菌株同源性高的已知菌種，利用Clustalx和MEGA等軟件，繪制系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離和篩選

菌株的產(chǎn)酸量高低與溶鈣圈大小成正比，由此分離純化出41株產(chǎn)酸明顯的乳酸菌，接種于MRS液體培養(yǎng)基中發(fā)酵后取上清液，用牛津杯雙層平板擴散法測定其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌能力。發(fā)現(xiàn)6株菌株上清液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用，其抑菌圈均大于17 mm，見表1。

表1 6株菌對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌情況Table 1 6 strains' inhibition on E.coli and Staphylococcus aureus mm

2.2 形態(tài)特征

將具有較強抑菌能力的6株乳酸菌進行形態(tài)學(xué)的初步鑒定[16]。各菌株的菌落和菌體形態(tài)特征見表2和圖1。

表2 乳酸菌的形態(tài)學(xué)特征Table 2 The morphologic characteristics of Lactobacillus

圖1 部分菌株的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)Fig.1 Colony and microscopic morphology of part strains

由表2和圖1可知，6株菌株菌落形態(tài)大致相同，菌落呈白色或乳白色，圓形，中央凸起，表面光滑濕潤，邊緣整齊；菌體形態(tài)呈短桿狀或球狀，無芽孢和鞭毛，單個或呈鏈狀，革蘭氏染色均呈陽性。

2.3 生長曲線及產(chǎn)酸特性分析

圖2 6株乳酸菌的生長曲線Fig.2 Growth curves of 6 strains of Lactobacillus

圖3 6株乳酸菌的產(chǎn)酸特性分析曲線Fig.3 The curves of acid production characteristics of 6 strains of Lactobacillus

由圖2和圖3可知，乳酸菌B1和B3具有類似的生長曲線，培養(yǎng)4 h后菌體大量繁殖，進入對數(shù)生長期，14 h時菌體量達到最大，進入穩(wěn)定期；乳酸菌A1和F1在培養(yǎng)2 h后進入對數(shù)期，14 h時進入穩(wěn)定期；乳酸菌C3在培養(yǎng)8 h左右時進入對數(shù)期，14 h時進入穩(wěn)定期；乳酸菌D2在培養(yǎng)14 h后菌體進入對數(shù)期，20 h后進入穩(wěn)定期。乳酸菌C3、D2和F1生長過程中pH值無較大變化；乳酸菌A1、B1和B3的pH值隨時間增加逐漸減小。pH值越低說明菌株產(chǎn)酸能力強，pH值變化小時產(chǎn)酸能力弱。其中，乳酸菌B1的產(chǎn)酸能力最強，發(fā)酵液的pH值共降低1.25；乳酸菌A1和B3的pH值分別降低1.02和1.11。低鹽發(fā)酵蔬菜中，乳酸菌的適應(yīng)期越短其繁殖能力越強，能盡快分離出有益物質(zhì)；乳酸菌的產(chǎn)酸能力決定了產(chǎn)品的風(fēng)味和口感，也在一定程度上延長了產(chǎn)品的貨架期，抑制了腐敗菌的生長，起到防腐的作用[17]。因此，選擇適應(yīng)期短、產(chǎn)酸能力強的乳酸菌作為生產(chǎn)用菌株。由此可知，在低鹽發(fā)酵蔬菜生產(chǎn)中，乳酸菌A1、B1和B3更具潛力。

2.4 耐受性分析

2.4.1 溫度耐受性

蔬菜發(fā)酵過程中，溫度通過影響生物大分子的功能特性、細胞結(jié)構(gòu)以及胞內(nèi)酶的活性等來影響微生物的生長和繁殖，張?zhí)m威[18]的研究表明較高的溫度有助于混合生長菌株的比例達到平衡。因此，選擇溫度耐受性高的菌株，有利于產(chǎn)品品質(zhì)和風(fēng)味的提升。

圖4 6株菌的溫度耐受性曲線Fig.4 Temperature resistance curves of 6 strains of Lactobacillus

由圖4可知，乳酸菌A1，B1，B3對溫度的耐受性較高，在溫度為39 ℃時仍能較好地生長。其余3株乳酸菌對溫度的耐受性較差。

2.4.2 pH耐受性

蔬菜發(fā)酵過程中，溶液酸度不斷增加，pH值逐漸降低。pH對乳酸菌的活性有很大的影響，過高酸度的條件下，乳酸菌的活性受到抑制，影響乳酸菌的生物酶活性以及細胞吸收和代謝的能力[19]。因此，研究乳酸菌對pH的耐受性，篩選出能在高酸性條件下生長的乳酸菌，以維持發(fā)酵的正常進行。

圖5 6株乳酸菌的pH耐受性曲線Fig.5 pH resistance curves of 6 strains of Lactobacillus

由圖5可知，乳酸菌的生長繁殖能力隨著pH的增大而增強。pH在4～6時，6株乳酸菌均生長良好；而在pH為2～4時，乳酸菌的生長均受到不同程度的抑制。其中乳酸菌B1在高酸性環(huán)境下，表現(xiàn)出較好的pH耐受性。

2.4.3 鹽度耐受性

圖6 6株乳酸菌的耐鹽性曲線Fig.6 Salt resistance curves of 6 strains of Lactobacillus

由圖6可知，發(fā)酵的過程中，隨著鹽濃度的升高，6株乳酸菌的生長都受到了不同程度的抑制。但低鹽發(fā)酵蔬菜中鹽濃度都低于6%，因此選擇在0～8%鹽濃度范圍內(nèi)活性高的乳酸菌作為生產(chǎn)用菌株[20]。乳酸菌A1、B1、B3、C3在低鹽濃度下生長良好，較適合于生產(chǎn)發(fā)酵。

2.5 乳酸菌B1的16S rRNA序列分析結(jié)果

綜上試驗結(jié)果，選擇生長迅速、產(chǎn)酸量高，對溫度、pH、鹽濃度的耐受性都較強的乳酸菌B1進行分子學(xué)生物鑒定。電泳檢測結(jié)果顯示乳酸菌B1在約1500 bp之間有明顯的電泳條帶。

將乳酸菌B1的基因序列與數(shù)據(jù)庫中已有的細菌基因序列進行比對，其序列與植物乳桿菌的同源性為100%。利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖7。乳酸菌B1與植物乳桿菌的系統(tǒng)位置最為接近，與布氏乳桿菌和干酪乳桿菌等形成的同源簇有明顯的差異。因此，乳酸菌B1被鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。

圖7 乳酸菌B1基于16S rRNA序列進行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of Lactobacillus B1 based on the 16S rRNA sequence

3 結(jié)論

川西彝族傳統(tǒng)酸菜作為具有民族特色的健康食品，被越來越多的人們所認同，市場潛力大。然而對川西彝族傳統(tǒng)酸菜中功能微生物的研究近乎空白，因此，本文從川西彝族傳統(tǒng)酸菜汁中分離純化出產(chǎn)酸量較高的41株乳酸菌，經(jīng)抑菌實驗，優(yōu)選出6株抑菌能力較強的乳酸菌，編號依次為A1、B1、B3、C3、D2、F1。為篩選得到適用于低鹽發(fā)酵蔬菜的乳酸菌，研究了6株菌的生長曲線以及產(chǎn)酸能力、溫度耐受性、pH耐受性和鹽度耐受性，最終選出綜合性能較好的乳酸菌B1，對其16S rRNA序列進行分析，鑒定其為植物乳桿菌。通過一系列理化、耐受性分析發(fā)現(xiàn)乳酸菌B1是一株極具應(yīng)用潛力的菌株。在后續(xù)實驗中，可將其應(yīng)用于低鹽發(fā)酵蔬菜中，進一步優(yōu)化發(fā)酵工藝條件。也可豐富發(fā)酵食品微生物，對推動民族食品的開發(fā)及工業(yè)化生產(chǎn)具有積極的意義。