基于CV-ANN技術的花椒色素類成分含量 快速無損檢測研究

陳茜,韋志強,徐曉雪,譚超群,范文翔,吳純潔,袁星

(成都中醫藥大學,成都 611137)

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)，蕓香科花椒屬植物，主產于四川、甘肅、陜西、山東、河北等地[1]。花椒作為我國的“調八味”之一，因其獨特的麻味，廣泛用于川菜調味。果皮顏色作為花椒主要的感官指標之一，對其外觀品質評價具有重要意義。花椒果皮顏色由其內含多種色素類成分的相對含量共同決定，其中花椒果皮綠色部位主要與葉綠素含量有關[2-4]；果皮黃色部位主要與黃酮類成分含量有關，以槲皮素類黃酮苷為主[5,6]；果皮紅色部位主要與花青素類成分有關[7]。現代研究表明，包括黃酮、多酚、花青素、葉綠色等在內的多種色素類成分具有廣泛的藥理活性，如抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗衰老等[8-13]。

目前，花椒的品質評價方法主要包括高效液相色譜法(HPLC)[14]、氣相色譜法(GC)[15]、紫外光譜分析法(UV)[16]等，以上分析方法具有一定破壞性、費用高、耗時多等缺點。機器視覺(CV)利用圖像處理技術獲得樣品外觀特征參數，將樣品顏色信息數字客觀化，具有無損、低耗、快速等優點，廣泛應用于食品領域中[17]。據相關研究報道，花椒顏色與其內在成分存在著一定相關性。Tao等研究發現花椒顏色與揮發油、總酰胺以及雜質含量間具有顯著相關性，并且通過顏色分析快速檢測了揮發油、總酰胺以及雜質的含量，實現了花椒品質的分級[18]。郭換等研究表明花椒顏色與其黃酮類成分具有一定相關性，認為可通過花椒顏色的測定為其品質評價提供依據。

花椒色素類成分是花椒顏色的物質基礎，可作為花椒品質評價的重要參考指標。目前尚未有花椒色素類成分的快速無損分析方法，因此，本研究采用機器視覺技術獲得不同來源花椒的顏色值，探討顏色值與花椒中黃酮、多酚、花青素、葉綠素含量間的相關性，借助人工神經網絡模型(ANN)通過顏色值快速預測花椒色素類成分含量(見圖1)，為花椒色素類成分的快速無損檢測提供新方法，為花椒品質的快速無損評價提供參考與借鑒。

圖1 CV-ANN技術快速預測花椒色素類成分含量技術路線圖Fig.1 The scheme design for fast prediction of pigments content of Zanthoxylum bungeanum using CV-ANN

1 儀器和材料

Autoscience AS 5150A超聲波清洗器 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；UPT-11-10T優普系列超純水器 成都超純科技有限公司；BP211D型電子分析天平 德國賽多利斯股份有限公司；HX-200型粉碎機 浙江省永康市溪岸五金藥具廠；LXJ-Ⅱ離心機 上海醫用分析儀器廠；機器視覺系統 自制。

對照品蘆丁、沒食子酸、矢車菊-3-O-葡萄糖苷：購自成都曼斯特生物科技有限公司；水：超純水；甲醇、無水乙醇、濃鹽酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、福林酚試劑、碳酸鈉、丙酮等：均為分析純，購自成都市科龍化工試劑廠。

本次試驗收集了四川漢源、陜西韓城、甘肅宜東、甘肅秦安、甘肅武都、安徽亳州藥材市場、康美藥業股份有限公司的花椒樣品，共60批，見表1。

表1 不同來源花椒樣品信息Table 1 Information of Zanthoxylum bungeanum from different sources

2 方法與結果

2.1 顏色測定

2.1.1 機器視覺系統的構建

如自學習《鴉片戰爭》時，鴉片戰爭打開了我國的大門，為我國帶來了侵略、傷害。但同時進了我國自然經濟的解題，讓我過從封閉天國轉變出來，開始面向社會。它也成為了我國現代史的開端，所以學生不能夠從單一的角度去認識和學習它，而要從辯證的角度去看待它。

本實驗的機器視覺系統(自制)包括圖像采集系統與智能計算機圖像分析系統。就圖像采集系統而言，光源穩定性是保證樣品顏色客觀量化的重要條件，本圖像采集系統選用封閉式拍照箱，以白色為背景，以日光燈(Philips Master TL-D 90 De Luxe 18 W/950)作為光源，以排除外界環境光的干擾，相關參數設置如下：色溫為5000 K。以配有鏡頭(EF-S 60 mm f/2.8)的佳能相機(EOS 60D，Canon Inc.，Japan)作為圖像采集儀器，相關參數設置如下：像素為5184×3456；光圈值：8；曝光時間：1/13 s；感光度(ISO)：200；顏色表示：sRGB顏色空間模型。智能計算機圖像分析系統是機器視覺系統將顏色數字化的關鍵與核心。由圖像采集系統前期采集得到的圖像，首先采用閾值分割算法扣除白色背景獲得樣品特征區域，然后利用計算機提取該樣品區域每個像素點的R(紅色)、G(藍色)、B(綠色)值，并通過顏色轉換公式將sRGB顏色空間模型轉化成CIE L*、a*、b*顏色空間模型(L*值為亮度，a*為紅色至綠色的范圍，b*為黃色至藍色的范圍)。

2.1.2 光源穩定性考察

稱取5 g漢源花椒顆粒(No.7)置于玻璃皿(d=3 cm)中，放入機器視覺系統封閉式拍照箱，使花椒樣品擺放于相機視野中央，在同一拍攝角度，每隔一定時間拍攝1次，在90 min內采集圖像，載入智能計算機圖像分析系統測定顏色值，確定光源穩定時間。

圖2 光源穩定性考察Fig.2 Study on the stability of light sources

由圖2可知，顏色R、G、B值的在60 min后趨于穩定，燈光穩定時間為60 min，所以樣品顏色測量確定為系統燈光打開60 min以后開始執行。

2.1.3 精密度考察

花椒拍攝取樣前，打開燈光60 min使光源趨于穩定，光源穩定后，進行正式拍攝取樣。稱量5.0 g漢源花椒顆粒(No.7)置于玻璃皿(d=3 cm)，放入機器視覺系統封閉式拍照箱中，使樣品擺放于相機視野中央，于同一拍攝角度進行圖像取樣，重復拍攝6次。將圖像導入圖像處理系統進行顏色特征提取，分別輸出R、G、B顏色值。3個顏色量度值的RSD分別是0.49%，0.45%，0.41%，說明顏色測定方法精密度良好。

2.1.4 花椒顏色測定

不同來源的花椒樣品顏色表現出明顯差異，從深紅色到黃褐色各不相同，其中以漢源花椒顏色最紅，亳州藥材市場所購花椒的顏色則更偏于黃褐色。不同來源花椒樣品的CIE L*、a*、b*值見表2。

表2 不同來源花椒顏色L*、a*、b*值Table 2 L*，a*，b* values of Zanthoxylum bungeanum from different sources

a*值與花椒的紅色程度密切相關，漢源和武都的a*值平均值相對較高，分別是14.29，13.91，表明以上2種花椒的顏色在10種不同來源的花椒中更紅，與肉眼觀察的經驗鑒別結果一致。10種不同來源花椒的L*值范圍為37.83～42.51，b*值范圍為4.49～14.19，均具有較大差異。

2.2 花椒色素類成分測定

2.2.1 黃酮類成分含量測定

采用改進的亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法[19]測定。精密吸取0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL的0.2 mg/mL蘆丁標準品溶液于20 mL干凈試管中，分別加入5% NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加入10% Al(NO)3溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加入10%氫氧化鈉試液10 mL，用乙醇補至20 mL，搖勻，放置15 min，在波長508 nm處以第一管為空白測定吸光度，制作標準曲線，得回歸方程為y=10.729x-0.0089(R2=0. 9992)，線性范圍為0.01～0.05 mg/mL。各稱取1 g不同來源的花椒粉末(過40目篩)，加入30 mL 60%乙醇中，超聲0.5 h，離心，得到樣品液。精密移取0.2 mL樣品液于20 mL的干凈試管中，以60%乙醇做空白對照，按照上述操作顯色并測定吸光度，計算樣品濃度和黃酮含量。由表3可知，黃酮含量以漢源花椒最高(179.62 mg/g)，康美藥業有限公司最低(114.30 mg/g)。

表3 不同來源花椒色素類成分含量Table 3 Pigments content of Zanthoxylum bungeanum from different sources

由表3可知，葉綠素含量以安徽亳州藥材市場花椒最高(127.84 μg/g)，武都花椒最低(38.79 μg/g)。

2.2.2 多酚類成分含量測定

采用改進的福林酚試劑比色法測定[20]。精密吸取0.00，0.25，0.5，0.75，1.00，1.25 mL的0.1 mg/mL沒食子酸標準品溶液于25 mL容量瓶中，加入2 mol/L福林酚試劑4 mL，混勻，靜置4 min，加入10% NaCO38 mL，混勻，超純水定容至刻度，放置顯色2 h，在765 nm處以第一管為空白測定吸光度，制作標準曲線，得回歸方程為y=0.1305x-0.0013(R2=0.9993)，線性范圍為1～5 μg/mL。稱取1 g花椒粉末(過40目篩)于30 mL 60%乙醇中，超聲0.5 h，離心，得到樣品液。吸取0.05 mL分別置于25 mL試管中，以60%乙醇做空白對照，按照上述操作顯色并測定吸光度，計算樣品濃度和多酚含量。由表3可知，多酚含量以漢源花椒最高(56.74 mg/g)，康美藥業有限公司花椒最低(34.75 mg/g)。

2.2.3 花青素含量測定

采用改進的比色法進行測定[21]。精密吸取2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL的10 μg/mL花青素標準品溶液至10 mL容量瓶中，0.1%鹽酸甲醇溶液定容，在520 nm處以0.1%鹽酸甲醇為空白測定吸光度，制作標準曲線，得回歸方程為y=0.0674x-0.0045(R2=0.9993)，線性范圍為2～10 μg/mL。稱取1 g花椒粉末(過40目篩)于30 mL 0.1%酸性甲醇中，超聲0.5 h，離心得到樣品液，按照上述操作測定吸收度，計算樣品濃度和花青素含量。由表3可知，花青素含量以漢源花椒最高(112.89 μg/g)，亳州藥材市場含量最低(49.15 μg/g)。

2.2.4 葉綠素含量測定

參考孫俊寶等[22]的葉綠素含量測定方法，稱取1 g花椒粉末(過40目篩)于研缽中，加入10 mL 80%丙酮和無水乙醇(1∶1)，暗處靜置12 h，離心，取適量上清液分別在645，663 nm下測定吸光度值A，計算葉綠素含量，見表3。計算公式如下：

葉綠素的總含量(μg/g)=(20.29A645+8.04A663)V/W。

式中：A645和A663分別為相應波長下的吸光度值，V為提取液的體積(mL)，W為花椒樣品質量(g)。

2.3 相關性分析

使用SPSS 20.0分別將花椒的顏色CIE L*、a*、b*值與花椒的黃酮、多酚、花青素和葉綠素含量進行Pearson相關性分析，見表4。花椒的黃酮、多酚和花青素含量與L*值呈顯著負相關(p<0.05)，相關系數分別為-0.693，-0.765，-0.753；三者與顏色值a*呈顯著正相關(p<0.05)，相關系數分別為0.771，0.721，0.880，說明在一定程度上L*值越小，a*值越大，花椒中總黃酮、多酚和花青素的含量越高; 而葉綠素與a*值呈顯著負相關，相關系數為-0.861，且與b*值呈顯著正相關，相關系數為0.888,說明在一定程度上a*值越小，b*值越大，花椒中葉綠素的含量越高;花青素的含量與顏色值b*也呈顯著負相關，相關系數為-0.700，說明在一定程度上b*值越大，花青素含量越低。相關性分析結果表明，花椒的顏色CIE L*、a*、b*值與花椒中4種色素類成分含量存在著一定相關性，由機器視覺系統得到的顏色值在一定程度上能夠反映花椒中色素類成分的含量。

表4 花椒顏色值與色素類成分含量相關性分析Table 4 Correlation analysis of color value and pigments content of Zanthoxylum bungeanum

注：“*”表示顯著，“**”表示極顯著。

2.4 人工神經網絡模型分析

人工神經網絡模型(ANN)由輸入層、隱藏層和輸出層構成，每一層均包含若干個神經細胞。隱藏層的數量無限制，一個隱藏層基本具備接近預測結果和非線性函數的能力[23,24]。在人工神經網絡模型中，本研究采用matlab工具箱預測花椒的黃酮、多酚、花青素和葉綠素含量。在神經網絡的輸入層具有3個神經元，分別代表花椒顏色特征的3個顏色指標L*、a*、b*值。神經網絡的輸出層具有4個神經元，分別代表花椒的黃酮、多酚、花青素和葉綠素含量。本試驗采用反向傳播算法(BP)對人工神經模型進行訓練，在輸入人工神經網絡模型前，需要將輸入數據進行標準化，數值從0～1不等；此外，我們分別采用Tangent-sigmoid和Log-sigmoid傳遞函數在隱藏層和輸出層中進行數據傳輸；采用Levenberg-Marquardt(LM)算法使誤差最小化。

隱藏層中神經元的數量是影響人工神經網絡結果準確性的重要因素之一。為確定隱藏層神經元的最優數量，我們以最小標準誤差(RMSE)作為評價指標，采用試錯法依次計算了1～10個隱藏層神經元所對應的RMSE。60個花椒樣本中，70%的花椒隨機樣本用于訓練模型，15%的花椒隨機樣本用于數據驗證，15%的花椒隨機樣本用于測試。花椒黃酮、多酚、花青素和葉綠素的訓練集、驗證集以及測試集不同隱藏層神經元數量的平均RMSE見表5。

表5花椒色素類成分不同隱藏層神經元數量的RMSE值比較

Table 5 Root mean square error value of different number of nodes in the hidden layer for pigments of Zanthoxylum bungeanum

由表5可知，花椒的黃酮、多酚、花青素和葉綠素含量預測網絡模型中隱藏層神經元最優數量分別是5，5，9，6，其對應的RMSE分別為2.02±0.08，1.27±0.30，1.24±0.12，2.41±1.03。

花椒中黃酮、多酚、花青素和葉綠素實測值與預測值的相關性見圖3。

圖3 花椒色素類成分實測值與預測值的相關性分析Fig.3 Correlation analysis between the predicted values and experimental values of pigments content

由圖3可知，花椒黃酮實測值與預測值的相關系數R2為0.9881；多酚實測值與預測值的相關系數R2為0.8797；花青素實測值與預測值的相關系數R2為0.9842；葉綠素實測值與預測值的相關系數R2為0.9854；說明人工神經網絡基于機器視覺得出的顏色值在一定程度上能夠較準確地預測出花椒中黃酮、多酚、花青素和葉綠素的含量，機器視覺-人工神經網絡可作為花椒色素類成分快速無損檢測的一種新方法與手段。

3 討論

花椒外觀品質的三大評價指標為“色”、“香”、“味”，其對應的物質基礎分別是花椒中的色素、揮發油和酰胺類成分，目前花椒的相關文獻研究以揮發油和酰胺類成分為主。花椒的黃酮、多酚、花青素和葉綠素為天然性色素，性質較為穩定，均具有多種藥理活性。因此，花椒中色素類成分的測定可作為花椒品質的評價指標。

花椒外觀顏色的經驗鑒別描述受主觀影響較大，缺乏客觀性與準確性，通過機器視覺將花椒外觀顏色數字化，得到顏色的客觀量化值，避免了個體差異對花椒顏色描述的影響，可達到快速、精確測定花椒顏色的目的。因此，通過機器視覺技術將花椒顏色客觀量化，能夠用于其色素類成分含量的預測。

人工神經網絡以機器視覺系統獲得的花椒顏色值作為輸入值，以花椒中黃酮、多酚、花青素和葉綠素含量為輸出值，通過分析顏色值與色素類成分含量間的相關性并反復訓練，建立了能夠通過顏色值預測各色素類成分含量的數據模型。因此，機器視覺-人工神經網絡聯用技術能夠實現花椒色素類成分的快速無損檢測，解決了傳統分析方法測定色素類成分耗時多、試劑消耗大、不便利等缺點，可作為花椒品質快速評價的一種新方法。但本次研究樣本量仍偏小，后期還應增加樣本量，以提高預測的精確度與準確度。