落葵種子色素提取及其抑菌作用研究

楊海韞，盧坤，王庭欣

(河北大學 質量技術監督學院，河北 保定 071000)

落葵為落葵科落葵屬中以嫩莖葉供食用的一年生纏繞性草本植物[1]。成熟的果實為紫紅色，其漿汁內有大量甜菜花青素和甜菜紅色素[2]。資料顯示落葵色素具有抑菌、保鮮的作用[3]，常用作香腸和化妝品的著色劑，與紅曲色素有著類似的著色效果[4]。近年來有關落葵色素的研究多集中于對其化學性質的研究，對其提取條件的探究報道較少[5，6]。為落葵色素的開發利用，本研究對其提取條件進行了探討并對其抑菌作用進行了初步研究，為落葵種子色素的進一步研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

氫氧化鈉、石油醚、乙酸乙酯、乙醚、無水乙醇、甲醇、丙酮、鹽酸等：均為分析純；落葵果實干種子：河北大學質量技術監督學院實驗室提供；菌種：金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、大腸桿菌(8099)，河北大學質量技術監督學院微生物實驗室提供。

1.2 儀器與設備

多功能攪拌機 蘇泊爾股份有限公司；V-1100D型可見光分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；離心機 上海安亭科學儀器廠；PTX-FA210S型電子天平 福州華志科學儀器有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司；摩爾元素機 重慶摩爾水處理設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 落葵種子色素的提取

1.3.1.1 最佳提取溶劑的確定

選擇純水；有機溶劑：石油醚、甲醇、乙酸乙酯、無水乙醇。無水乙醇體積分數分別為95%,80%,70%,50%,20%。各取20 mL作為提取劑，分別加入0.5 g粉碎的落葵種子，充分搖勻后，浸提1 h，觀察顏色。取落葵色素溶液稀釋后，以純水為參比液，用可見光分光光度計在波長400～600 nm 的范圍內以20 nm為間隔掃描，測定吸光度，通過比較最大吸光度得到落葵種子色素吸收的最適波長。以純水代替溶劑作空白對照, 根據吸光度大小確定最佳提取溶劑。重復3次，取平均值。

1.3.1.2 最佳提取溫度和時間的確定

準確稱量2 g落葵種子試樣于12個100 mL容量瓶中，用純水定容。平均分為4組，1組在室溫放置，另外3組分別在恒溫40,60,75 ℃的水浴鍋中加熱，每組容量瓶分別在浸提20,30,60 min后取出。待溶液冷卻至室溫后，用分光光度計以蒸餾水作為空白對照，在最適波長下測定吸光值，比較最大吸光值，確定最佳提取溫度與時間。重復3次，取平均值。

1.3.1.3 最佳提取pH值的確定

最佳提取條件下取得的色素溶液各1.0 mL分別加入8支比色管中，用鹽酸溶液與氫氧化鈉溶液配制pH值梯度在2.0～9.0的酸堿度不同的溶液，分別加入8支比色管中定容至50.0 mL，觀察試管中溶液顏色，并測定在最佳波長下的吸光度，以確定其最佳pH值。重復3次，取平均值。

1.3.1.4 最佳提取液料比的確定

準確稱取1.0 g落葵種子試樣5份，分別加入12,16,18,20,24 mL的蒸餾水，浸提30 min，以8000 r/min離心12 min，取相同體積上層清液于比色管中，以蒸餾水為空白對照，測定不同條件提取的溶液在最適波長下的吸光度，確定最佳液料比。重復3次，取平均值。

1.3.1.5 最佳提取次數的確定

在最佳浸提條件下浸提0.5 g種子樣品，浸提至無色，分別收集每次色素溶液，測定其體積和吸光度。計算浸提率，確定最佳提取次數。

1.3.1.6 最佳濃縮干燥條件的選擇

取等量落葵色素提取液于錐形瓶中，分成2組，一組置于水浴鍋中在40 ℃蒸發干燥，另一組于室溫干燥。稱量并記錄錐形瓶干燥后的重量，比較2種條件下的干燥效果。

1.3.2 落葵果實色素正交實驗

確定最佳提取液為水，1∶18為最佳液料比為固定條件，以溫度、提取時間和pH值為3個因素并擬定3個程度，設計L9(34)正交實驗，進行提取實驗，將提取液稀釋定容至相同體積，在最適波長540 nm下測定各自的吸光度，確定最佳提取條件。正交實驗設計表見表1。

表1 正交實驗設計表Table 1 Orthogonal experiment designTable

1.3.3 落葵果實色素溶液的制備

稱量0.5 g粉碎的落葵果實試樣，加入8 mL無菌水，浸取30 min后，以10000 r/min離心10 min，取上層清液，用無菌水配成50%,10%,1% 3種不同濃度的落葵果實色素溶液備用。

1.3.4 落葵果實色素提取液的抑菌試驗

用滅菌的牛肉膏-蛋白胨液體培養基分別對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌在37 ℃，24 h進行增菌，菌液濃度為106個/mL。采用滅菌的瓊脂培養基制成平板，分別取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌2種菌懸液各0.2 mL制成菌平板，每個平板放3片浸有不同濃度樣品的濾紙片做平行樣品，并設陰性對照(無菌)在37 ℃，24 h培養，觀察抑菌圈大小。

2 結果與討論

2.1 落葵果實色素單因素實驗

2.1.1 最佳提取溶劑的確定

表2 不同浸提液效果Table 2 Different extract's effects

由表2可知，呈現紫紅色的純水浸提液浸提效果最好，浸提液呈現淡黃色的有機溶劑的提取效果較差，乙醇溶液隨著濃度增加，浸提效率逐漸降低；根據相似相溶的性質，落葵紅色素為水溶性色素。確定水是最佳提取液，相較而言水的成本低，符合實際生產工藝的要求。

2.1.2 最佳提取溫度和時間的確定

表3 不同溫度和時間浸提液效果比較Table 3 Comparison of extract's effects at different temperatures and time

由表3可知，溫度對色素的穩定性影響較大，室溫下隨著提取時間的加長，色素的提取效果逐步提升，而高溫下，隨著時間的加長，色素提取效果下降。結合實際生產降低成本、減少流程步驟的需要，故選擇最佳提取溫度為室溫，提取時間為30 min。

2.1.3 最佳提取pH值的確定

表4 不同pH值浸提液效果比較Table 4 Comparison of extract's effects of different pH values

由表4可知，色素在酸性環境下吸光度較大，吸光值在pH 4～6之間達到峰值，綜合工業需求，考慮選擇pH 5為最佳提取條件，同時在浸提工藝中可以加入鹽酸或者醋酸為pH調節劑，增加色素穩定性。

2.1.4 最佳提取液料比的確定

表5 不同液料比浸提液效果比較Table 5 Comparison of extract's effects of different liquid-material ratios

由表5可知，液料比越大，提取效果越好；在液料比1∶18之后，提取效果基本穩定，提取率變化幅度小。綜合考慮實際生產經濟和后續濃縮的需要，選擇1∶18為最佳提取液料比。

2.1.5 最佳提取次數的確定

表6 不同浸提次數浸提液效果比較Table 6 Comparison of extract's effects of different extraction times

由表6可知，浸提次數越多，提取率越大。提取3次后，提取率增加不明顯，出于成本考慮，確定最佳提取次數為3次。

2.1.6 最佳濃縮干燥條件的選擇

表7 不同干燥條件比較Table 7 Comparison of different drying conditions

由表7可知，水浴蒸干用時短，色素得率高。自然干燥不僅耗時長，且易引起色素變質，因此確定最佳干燥條件為水浴蒸干。

2.2 落葵果實色素正交實驗

表8 正交實驗方案及結果Table 8 Orthogonal experimental scheme and results

由表8可知，根據極差 R 值，不同水平因素對色素提取率影響的主次順序為 A>C>B，溫度為主要影響因素，由此確立最佳提取工藝為 A1B1C1，A1B2C2，綜合考慮，選擇提取溫度 25 ℃、pH值5、時間30 min 為最適條件。

2.3 落葵果實色素抑菌實驗

采用卡尺測量抑菌圈直徑的方法對落葵果實色素的抑菌性進行了研究。結果顯示：在含有浸泡原液、50%濃度、10%濃度、1%濃度濾紙片的大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的含菌平板上均無明顯抑菌圈，初步判斷落葵果實色素無抑菌作用。

3 討論

本文對落葵種子色素提取條件的優化做了初步探討。落葵種子色素的提取條件為：將原料清洗后，烘干，粉碎；以純水為提取劑，在pH 4～6條件下用1∶18的液料比，將原料于常溫下浸提 3 次，每次30 min，浸提液可以經高速離心后過濾或直接過濾后，用恒溫水浴蒸干，色素在高溫下易變質，水浴溫度宜控制在40 ℃以下。本文得出的落葵種子色素提取的最適吸收波長、最佳提取液、最適pH值、最適提取溫度等提取條件與目前所存文獻基本一致。在判斷指標上，張美榮等采用色價為比較項目，更加便于判斷色素的品質。與以往文獻相比，本研究結果更加確切，pH的范圍進一步縮小，為生產提供了可靠依據。本文對落葵種子色素的抑菌性做了探究，進一步拓寬了對落葵種子色素性質的了解；較為全面地探究了落葵種子色素的提取條件，為落葵種子色素進一步開發利用奠定了基礎。