種曲工藝參數優化及其在醬油生產中的應用

王惠芳，樊君，榮秋亮，羅紅剛，劉書亮

（1.四川農業大學 食品學院，四川 雅安 625014；2.千禾味業食品股份有限公司，四川 眉山 620010）

醬油是人們生活中必不可少的調味品。隨著人們生活水平的改善，對醬油品質的要求也越來越高。種曲作為醬油釀造的關鍵因素，對醬油的品質至關重要。優質的種曲可提高出品率以及提升風味、口感和感官體態。低劣的種曲會導致圓盤制曲的酶活力低，影響原料全氮利用率，醬醪布醬困難，不易出油，導致巨大的經濟損失。自動種曲機培養的種曲質量好，勞動強度低，細菌總數顯著改善［1，2］。本文以中科3.951米曲霉為菌種，研究了種曲機制曲工藝參數對種曲質量的影響，通過單因素和正交試驗優化了種曲機制曲工藝參數，并對比了優化前后種曲對醬油品質的影響，以期為醬油釀造提供優質的種曲。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗儀器

CX31型生物顯微鏡 日本奧林巴斯有限公司；血球計數板 上海求精生化試劑儀器有限公司；AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺 蘇州凈化設備公司；ALKOMAT密度計 奧地利安東帕公司；W2S-185A型雷磁濁度儀 上海儀電科學儀器股份有限公司；100kg種曲機 千禾味業食品股份有限公司。

1.1.2 試驗菌種

3.951 米曲霉：購自中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC），凍干管。

1.1.3 斜面培養基

豆汁培養基：大豆常溫浸泡12h，加5倍水，小火煮沸1h過濾，調節濃度為5°Bé，加入2%瓊脂，分裝滅菌，制成斜面。

1.1.4 原料要求

麩皮：水分11%～13%，粗蛋白11%～14%，20目過篩率為40%～45%；酵母抽提物：國家標準GB／T 23530－2009《酵母抽提物》中純品型［3］；空氣為無菌空氣，補水為無菌水。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化

將凍干菌種3.951無菌操作接入豆汁斜面培養基，30℃培養5天，待斜面長滿綠色的孢子，再無菌傳代2次，每次培養5天，獲得孢子密集的斜面種子。

1.2.2 三角瓶種子的制備

麩皮500g加入水500mL拌勻，搓碎去除團塊，潤水30min，再次混勻，分裝于500mL三角瓶中，每瓶30g，其厚度約為1cm。塞透氣硅膠塞子，包扎防潮紙，蒸汽加壓滅菌0.1MPa，維持30min。滅菌冷卻后，無菌接入2環試管斜面種子，30℃生化培養箱中靜置培養。培養17～19h后，曲料表面布滿白色菌絲并結塊時第1次搖瓶，曲料充分搖散平攤于三角瓶底部。再培養4～6h，菌絲大量生長并結塊時第2次搖瓶，再次將曲料充分搖散平攤于三角瓶底部。培養48h后，曲料結塊可見大量的孢子時扣瓶，繼續培養至72h。

1.2.3 種曲機培養

種曲機投料共計100kg，按照試驗設計要求配制原料，其中根據試驗設計要求需要使用酵母抽提物的，先按照潤水比例取水，再將稱量好的酵母抽提物溶于水中，攪拌均勻后潤水。曲盤裝料，厚薄均勻，厚度約2cm。蒸料溫度121℃，20min。降溫至30℃時，接入4瓶三角瓶種子，按照試驗要求通風和補水，培養72h開罐出曲。種曲機培養種曲工藝流程見圖1。

圖1 種曲機培養種曲工藝流程Fig.1 The technological process of cultivating seed koji with seed koji machine

1.2.4 試驗設計

1.2.4.1 單因素試驗

分別針對潤水量、風量、補水量和酵母抽提物用量對種曲孢子數的影響進行單因素試驗。確定各個影響因素比較適合的范圍，為進一步采用統計學方法進行試驗優化提供有利的數據參考。潤水量單因素試驗：設計 70%，80%，90%，100%，110%，120%，130% 共計7個潤水梯度，補水量為60L／罐，通風量為1.5m3／h，30℃培養72h；風量單因素試驗：設計0.5，1，1.5，2，2.5m3／h 5個風量梯度，按照潤水量100%，補水量60L／罐，30℃培養72h；補水量單因素試驗：設計20，30，40，50，60，70，80，90L／罐8個補水梯度，按照潤水量100%，通風量為1.5m3／h，30 ℃培養72h；酵母抽提物用量單因素試驗：設計未添加酵母抽提物和0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%，3.5%8個梯度，潤水量為100%，補水量為60L／罐，通風量為1.5m3／h，30℃培養72h。

1.2.4.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選用L16（45）正交設計優化種曲培養條件。4個因素為潤水量、風量、補水量和酵母抽提物用量，每個因素設4個水平，同時設置空列。各因素的不同水平見表1。

表1 正交試驗L16（45）的因素和水平Table1 Factors and levels of orthogonal test L16（45）

1.2.4.3 驗證試驗

依照正交試驗確定的最佳工藝參數制種曲，對比優化前與正交優化后的孢子數及用于醬油生產的成曲和原油指標，驗證正交優化后的工藝參數。

操作要點：5kg大豆浸泡過夜，121℃加壓蒸煮30min，降溫30℃裹上15%的面粉，接種0.1%種曲，30℃培養45h得到醬油成曲，混入22%的鹽水10L，33℃發酵6個月。

1.2.5 數據測定方法

1.2.5.1 孢子數的測定

參照SB／T 10315－1999《孢子數測定法》［4］。

1.2.5.2 醬油理化指標的測定

參照 GB 18186－2000《釀造醬油》［5］。

1.2.5.3 乙醇的測定

相對密度法［6］。

1.2.5.4 濁度的測定

濁度儀測定法［7］，取20mL壓榨后的生醬油用濁度儀測定。

1.2.5.5 細菌總數的測定

平板計數瓊脂，成曲測定需加入防霉劑殺真菌素50mg／L。

1.2.5.6 中性蛋白酶活的測定

參照SB／T 10317－1999《蛋白酶活力測定法》［8］。

2 結果與分析

2.1 潤水量對種曲質量的影響

米曲霉生長需要一定量的水分，接入三角瓶的種子需在原料上吸水膨脹后發芽，然后菌絲大量繁殖，其生長過程需要耗掉大量的水分。所以原料必須有適量的潤水，試驗設計潤水量為70%，80%，90%，100%，110%，120%，130%共計7個潤水梯度，補水量為60L／罐，通風量為1.5m3／h，30℃培養72h，潤水量對種曲質量的影響見圖2。

圖2 潤水量對孢子數的影響Fig.2 Effect of water moisture on the number of spores

由圖2可知，隨著潤水量的增加，孢子數呈先上升后下降的趨勢，證明潤水量并不是越高越好，適宜的潤水量才適合米曲霉形成豐富的孢子。原料潤水為米曲霉生長提供了初始水分，潤水量過低，會影響孢子的萌發速度，菌絲變得瘦而短；潤水量過多，物料板結，米曲霉菌絲不易長入物料的內部，影響種曲質量。潤水量為100%時，物料疏松，料層通氧效果好，利于菌絲繁殖。相對而言，潤水量低對種曲質量影響較大，當潤水低于80%時，會嚴重影響種曲的質量。

2.2 風量對種曲質量的影響

米曲霉生長需要耗氧，因此風量會影響米曲霉的生長。試驗設計0.5，1，1.5，2，2.5m3／h 5個風量梯度，按照潤水量100%，補水量60L／罐，30℃培養72h，風量對種曲質量的影響見圖3。

圖3 風量對孢子數的影響Fig.3 Effect of air volume on the number of spores

由圖3可知，風量為1，1.5，2，2.5m3／h時種曲孢子數差異不大，但隨著風量的增加，孢子數降低，主要原因是風量增加，風速過快，會帶走物料的水分，從而影響米曲霉的生長。風量低于0.5m3／h時，則不能滿足米曲霉生長的耗氧需求，影響米曲霉生長。

2.3 補水量對種曲質量的影響

種曲培養需要72h，培養的過程需要通入無菌壓縮空氣以滿足米曲霉生長的耗氧需求，通風的同時也會帶走物料的水分，如不額外補水，會導致物料發干，米曲霉不能正常生長。試驗設計20，30，40，50，60，70，80，90L／罐8個補水梯度，按照潤水量100%，通風量為1.5m3／h，30℃培養72h，補水量對種曲質量的影響見圖4。

圖4 補水量對孢子數的影響Fig.4 Effect of water replenishment amount on the number of spores

由圖4可知，補水量為50～80L／罐時種曲孢子數變化不大，但隨著補水量的增加，孢子數有下降趨勢，而補水量過低對孢子數的影響較大。

2.4 酵母抽提物對種曲質量的影響

杜雙奎等［9］報道添加硝酸銨為米曲霉生長提供了氮源。楊蘭等［10］的研究結果顯示，酵母抽提物對醬油種曲生長的促進作用較為明顯。酵母抽提物為食品原料，含有多種氨基酸、維生素及礦物質，因此，選擇酵母抽提物為種曲促進劑，同時提供一定量的氮源。試驗設計未添加酵母抽提物和0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%，3.5%8個梯度，潤水量為100%，補水量為60L／罐，通風量為1.5m3／h，30℃培養72h，酵母抽提物用量對種曲質量的影響見圖5。

圖5 酵母抽提物用量對孢子數的影響Fig.5 Effect of yeast extract amount on the number of spores

由圖5可知，添加了酵母抽提物的種曲，其孢子數明顯高于未添加的。用量為2%時孢子數最高，但隨著用量的增加，孢子數無明顯提高。

2.5 正交試驗結果與分析

2.5.1 正交試驗結果與極差分析

表2 正交試驗結果表Table2 Orthogonal test results table

根據極差R的大小，可以判斷因素對試驗指標的影響主次順序，由表2可知，極差值R由大到小依次為B＞C＞D＞A，因此，風量對種曲質量的影響最大，補水量和酵母抽提物的用量次之，潤水量的影響相對較小。由k值的大小可判斷A、B、C、D各水平對本試驗指標的影響程度。優化后的組合為A3B3C3D4，即潤水量110%，風量2m3／h，補水量70L／罐，酵母抽提物用量2.5%，經無菌種曲機培養72h后的種曲質量最好。

2.5.2 正交試驗方差分析

表3 正交試驗方差分析表Table3 Variance analysis table of orthogonal test

由表3可知，因素B有極顯著性差異，因素C和D有顯著性差異，說明風量對種曲孢子數影響最大，補水量和酵母抽提物用量對種曲孢子數也有較大影響。因素A無顯著性差異，說明潤水量對種曲孢子數無顯著性影響。

2.6 驗證試驗結果與分析

2.6.1 種曲質量對比

優化后的工藝參數：潤水量110%，風量2m3／h，補水量70L／罐，酵母抽提物用量2.5%制種曲質量有較顯著提高，孢子數平均值由優化前的89.3億個／g（干基）提升到107.7億個／g（干基），提高了20.6%，進一步證明優化后的培養條件可以提高種曲質量。

2.6.2 醬油生產對比

將優化前與優化后的種曲用于圓盤制曲，成曲質量對比見表4。

表4 優化前后成曲質量對比Table4 Comparison of the finished koji quality before and after optimization

由表4可知，優化后的種曲用于圓盤制曲成曲細菌總數明顯降低，中性蛋白酶活略有提高，優化前的成曲略有氨味和酸味。孢子數較低的種曲圓盤制曲時，不能很好抑制雜菌生長，成曲中芽孢桿菌類增殖過多會導致成曲帶有氨味，而其他乳酸菌、微球菌等會導致成曲帶有酸味。優化前后醬油質量對比見表5。

表5 優化前后醬油質量對比Table5 Comparison of soy sauce quality before and after optimization

由表5可知，優化后的醬油濁度明顯降低，導致醬油渾濁的原因除原料中未分解的大分子物質外，另一個重要原因就是細菌性渾濁，比較優化前和優化后的醬油，生醬油中的細菌總數降低1個數量級。由于產酸細菌的減少，優化后的生醬油的總酸低于優化前的生醬油，氨基酸態氮、全氮均有提高。

3 小結

種曲機制曲工藝參數對種曲質量有較大影響，其中風量和補水量對種曲質量影響較大，而潤水量次之，酵母抽提物用量影響相對較小。米曲霉3.951用無菌種曲機培養的優化條件為：潤水量110%，通入風量2m3／h，補水量70L／罐，酵母抽提物用量2.5%。優化后種曲的孢子數可達100億個／g（以干基計）以上，用于圓盤制曲，成曲雜菌數降低，經發酵后的醬油品質較優化前有大幅提升。