響應面法優化紅提果醋的發酵條件

楊麗萍，單春會，唐鳳仙

（石河子大學 食品學院，新疆 石河子 832003）

紅提葡萄，又稱紅地球葡萄，是美國加州大學研制的雜交品種［1］。紅提因其穗大、皮厚、味美、耐貯運等優點而深受大眾喜愛［2］。新疆是我國紅提種植的主要區域［3］，但長期以來紅提都以鮮食為主，且基本為季節性產品，由于紅提產業化商品市場幾乎空白，致使紅提產業發展嚴重滯后［4］。

果醋是以水果或水果下腳料為原料，先酒精發酵再醋酸發酵而得到的新型飲料［5］。果醋因其降三高、抗菌、促進新陳代謝、抗衰老等眾多優點而受消費者推崇，是一款較好的功能性飲料［6］。果醋發酵方法分為固態發酵法、液態發酵法和前液后固發酵法［7］，固態發酵法是傳統發酵方法，液態發酵法則是新興的主流發酵方法，前液后固法則結合兩者的優缺點，其發酵方法尚不成熟［8］。

隨著人們對于食品健康及安全愈發重視，果醋因其保健功能及口感酸爽而越發受到關注［9］。但我國自主研發生產的果醋品種較為單一［10］，沙棘果醋、菠蘿果醋、黑加侖果醋、梨果醋等大多停留在實驗室階段［11－14］。本文針對紅提深加工產品較少以及其果醋產品報道較少的問題，采用響應面法優化紅提果醋的發酵工藝條件，以期釀造出口感柔和、色澤優良、典型性強的紅提果醋，為其工業化生產提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅提葡萄：新疆石河子市；安琪葡萄酒活性干酵母（BV818）：安琪酵母股份有限公司；醋酸菌（瀘釀1.01）：由石河子大學食品學院果蔬實驗室保藏；果膠酶（EX-V）：法國曼森公司；優質白砂糖（食品級）：市售；葡萄糖（分析純）：天津盛奧化學試劑有限公司；偏重亞硫酸鉀、檸檬酸（分析純）：天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-ZD無菌操作臺 蘇州蘇潔凈化設備有限公司；YXQ-LS-SⅡ高壓蒸汽滅菌鍋 濟南思卓醫療器械有限公司；GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機 賽默飛世爾科技有限公司；ZXSD-1160生化培養箱、ZWYRD2403觸摸屏搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；S-3CpH 計 上海精密科學儀器有限公司；MC202231手持糖度計 成都泰華光學有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 紅提果醋液態發酵工藝流程

原料→分揀清洗→除梗破碎→成分調整→滅菌→酒精發酵→過濾→殺菌→醋酸發酵→澄清→過濾→殺菌→陳釀→成品。

1.3.2 操作要點

1.3.2.1 原料預處理

選用新鮮紅提，揀出壞果、次果、雜質；清洗后瀝干，破碎（注意葡萄籽不破碎）；加入總體積0.006%的偏重亞硫酸鉀；依據1.7g糖發酵可生成1%酒精，按預計酒度加入白砂糖調整葡萄果漿糖濃度；用檸檬酸調節發酵液酸度至pH 3.8；加入發酵液總體積0.03%的果膠酶于葡萄果漿內以達到提高出汁率的效果；68℃下巴氏殺菌30min。

1.3.2.2 酵母活化

稱取發酵液總體積0.03%的釀酒活性干酵母于5%葡萄糖溶液中，于37℃條件下水浴活化30min。

1.3.2.3 酒精發酵

待發酵液冷卻后接入已活化的酵母菌液；將發酵液放入20℃恒溫培養箱中，每隔一段時間測量發酵液的可溶性固形物，待酒精度達到8%左右時停止酒精發酵；200目紗布粗濾后，6000r／min條件下離心10min，然后在68℃下巴氏殺菌30min。

1.3.2.4 醋酸菌培養及馴化

醋酸菌培養：首先將醋酸菌接種至固體培養基中進行1次活化培養，挑選長勢良好的醋酸菌接入液體培養基中在搖床中（180r／min，30℃）進行二次擴大培養。

醋酸菌馴化：將醋酸菌接入馴化培養液與紅提果酒（8∶2）混合的培養液中培養48h得到一級種子液，取一級種子液接入馴化培養液與紅提果酒（6∶4）得到二級種子液，以此類推直至四級種子液接入純紅提果酒中，此時得到的醋酸菌用于后續醋酸發酵。

1.3.2.5 醋酸發酵

在紅提果酒中接入已馴化的醋酸菌放置在搖床（180r／min，30℃）中進行有氧醋酸發酵，每天監控發酵液的酒精含量及總酸含量，在酸度不再上升時結束醋酸發酵。

1.3.2.6 后處理

紅提果醋中加入明膠、皂土，靜置澄清96h；4000r／min條件下離心10min；過濾；100℃條件下殺菌10min得到成品果醋。可依據喜好進行調配。

1.3.3 紅提果醋發酵的單因素試驗

選擇不同初始酒精度（4%，5%，6%，7%，8%）、不同發酵溫度（26，28，30，32，34℃）、不同冰醋酸添加量（0，0.5%，1%，1.5%，2%）、不同醋酸菌接種量（6%，8%，10%，12%，14%）4個因素進行單因素試驗，試驗結果以產品酸度為評價標準來確定合適的發酵條件范圍，以便進行后續響應面優化試驗。

1.3.4 紅提果醋響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，以初始酒精度、醋酸菌接種量、發酵溫度和冰醋酸添加量4個因素為自變量，以紅提果醋酸度為響應值，設計4因素3水平響應面分析試驗，以Design-Expert V8.0.6軟件對試驗進行回歸分析，響應面試驗因素和水平見表1。

表1 響應面設計試驗因素水平與編碼Table1 Independent variables and levels of the response surface design

1.3.5 測定方法

可溶性固形物：手持折光儀［15］；酸度：酸堿中和滴定法［16］；酒精度：蒸餾比重法［17］。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 初始酒精度對紅提果醋發酵的影響

圖1 初始酒精度對酸度的影響Fig.1 Effect of initial alcohol content on acidity

由圖1可知，在其他因素相同的條件下，初始酒精度為4%，5%時發酵液醋酸轉換率較低，酸度較小；當初始酒精度為6%時，發酵液酸度達到最大值6.89g／dL；當初始酒精度不斷增大時，發酵液醋酸轉換率反而減弱。這可能是因為當發酵液酒精度較小時，不能滿足醋酸菌的生長代謝，導致產酸能力差；當發酵液酒精度過高時，醋酸菌的活性又被抑制，從而導致產酸能力減弱［18］。因此，確定初始酒精度6%比較適合醋酸菌的生長。

2.1.2 醋酸菌接種量對紅提果醋發酵的影響

圖2 醋酸菌接種量對酸度的影響Fig.2 Effect of inoculation amount of acetic acid on acidity

由圖2可知，隨著醋酸菌接種量的增加，果醋酸度呈現先上升后下降的趨勢；當接種量為10%時，酸度達到峰值6.78g／dL；接種量超過10%，酸度逐漸降低。這可能是因為接種量越大，醋酸菌生長所需要的營養物質也越多，但發酵液中的營養物質有限，過多接種醋酸菌反而使其彼此競爭，導致醋酸產量減少。因此，確定醋酸菌接種量10%左右較為適宜。

2.1.3 發酵溫度對紅提果醋發酵的影響

圖3 發酵溫度對酸度的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on acidity

由圖3可知，當發酵溫度在26～30℃時，發酵液酸度呈現上升趨勢；發酵溫度為30℃時酸度最高；隨著發酵溫度的升高，發酵液酸度出現降低趨勢，當溫度超過32℃時，發酵液酸度明顯降低。這可能是因為發酵溫度過低時，醋酸菌無適宜的生長環境，活力較弱；發酵溫度過高時，則導致醋酸菌生長過快，菌體老化，產酸能力變弱。因此，確定發酵溫度為30℃左右較為合適。

2.1.4 冰醋酸添加量對紅提果醋發酵的影響

圖4 冰醋酸添加量對酸度的影響Fig.4 Effect of additive amount of glacial acetic acid on acidity

由圖4可知，發酵液酸度隨著冰醋酸添加量的變化呈現先增長后減弱的趨勢，冰醋酸添加量從0%變化至0.5%時，醋酸含量明顯增高；在冰醋酸添加量為1%時酸度達到最高值6.82g／dL；當冰醋酸添加量超過1%時，發酵液酸度逐漸降低。這可能是因為在發酵液中添加適量的冰醋酸能夠調整其酸度，使之更適宜醋酸菌生長，但當冰醋酸添加量過多時，造成發酵液酸性增強，抑制醋酸菌活性，降低了醋酸菌的產酸能力。因此，確定冰醋酸添加量為1%時較適合醋酸菌的生長。

2.2 響應面試驗優化結果

為確定紅提果醋各因素的最優工藝參數，采用響應面軟件設計4因素3水平的響應面優化試驗，以發酵液酸度為響應值，結果見表2。

表2 響應面分析試驗設計及結果Table2 Experimental design and result of response surface analysis

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析

應用 Design-Expert V8.0.6軟件對表2中的試驗數據進行回歸分析，得到紅提果醋酸度（X）的回歸方程為：X＝6.84＋0.042A＋0.11B＋0.084C＋0.062D－0.032AB＋0.065AC－0.052AD＋0.02BC＋0.015BD＋0.018CD－0.65A2－0.6B2－0.51C2－0.68D2，對二次回歸方程進行分析，其顯著性結果見表3。

表3 醋酸含量回歸模型方差分析Table3 Variance analysis of regression model on acetic acid content

由表3可知，模型P值＜0.01，說明該模型極顯著；失擬項P＞0.05，表現為不顯著；該模型一次項、二次項均達到顯著水平，說明各因素對試驗影響都較大，交互項僅AC顯著，其他均為不顯著，說明初始酒精度與冰醋酸添加量之間的相互影響較大，其他因素兩兩之間影響較小；由F值可看出各因素的影響順序依次為：B＞C＞D＞A，即醋酸菌接種量＞冰醋酸添加量＞發酵溫度＞初始酒精度；決定系數R2＝0.9746＞0.9，說明該模型能很好地表達試驗結果，僅3%的變化不能用此模型來解釋，該方程擬合度較好，模型預測值與實際值有較好的關聯性。

2.2.2 響應面分析及優化

圖5 各因素交互作用對果醋酸度影響的響應面圖Fig.5 Three-dimensional response surface diagram showing the interactive effects of different factors on acidity of fruit vinegar

響應面可以反映出各個因素間交互作用的顯著性，曲面變化相應表現為響應值變化的大小［19］。由圖5可知，初始酒精度、醋酸菌接種量、冰醋酸添加量、發酵溫度4個因素之間存在交互作用。圖5中a為初始酒精度與醋酸菌接種量的交互結果：響應曲面坡度較陡峭，且醋酸菌接種量坡度更為陡峭，說明二者交互作用顯著，醋酸菌接種量的影響大于初始酒精度的影響；圖5中b為冰醋酸添加量與初始酒精度的交互結果：等高線呈橢圓形，且冰醋酸添加量坡度明顯大于初始酒精度，說明二者交互作用顯著，冰醋酸添加量的影響大于初始酒精度的影響；圖5中c，d，e響應面圖均呈現先上升后下降的趨勢，有明顯的最大值，且等高線圖均呈橢圓形，說明其兩兩之間交互作用都較為顯著；圖5中f為發酵溫度與冰醋酸添加量的交互結果：響應面較為平緩，且等高線呈圓形，說明二者交互作用不顯著。

2.2.3 響應面驗證試驗

通過響應面分析，得到最佳發酵條件為初始酒精度6.03%，醋酸菌接種量10.19%，冰醋酸添加量1.04%，發酵溫度30.09℃，在此條件下發酵得到的紅提果醋酸度為6.85g／dL；考慮到實際操作的便利性，將最佳條件調整為初始酒精度6%，醋酸菌接種量10%，冰醋酸添加量1%，發酵溫度30℃，經3次重復試驗，實際紅提果醋酸度均值為6.79g／dL；實際結果與理論值偏差較小，表明該模型能較好地預測紅提果醋發酵工藝條件，具有實際應用價值。

3 結論

通過對單因素初始酒精度、醋酸菌接種量、發酵溫度、冰醋酸添加量對紅提果醋發酵過程中酸度的影響進行考察，利用響應面法對各因素之間的交互作用進行分析。得到以下結論：（1）4個單因素對紅提果醋產酸的影響順序為醋酸菌接種量＞冰醋酸添加量＞發酵溫度＞初始酒精度。（2）最佳發酵條件為初始酒精度6%，醋酸菌接種量10%，冰醋酸添加量1%，發酵溫度30℃；在此條件下得到酸度為6.79g／dL的紅提果醋。（3）響應面法預測理論值經實際驗證后，與實際結果相差無幾，說明此響應面模型具有實際價值。