檸檬葉精油的抗氧化活性及其相關(guān)性分析

陳林林，李偉，韓可，吳嘉樹

（哈爾濱商業(yè)大學(xué) 省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150076）

檸檬葉是黎檬或者洋檸檬的葉，作為獨(dú)特香辛料被使用在東南亞菜品中，清香味道十分強(qiáng)烈，用于海鮮、肉類和沙拉類菜品中，使菜肴更加鮮美。檸檬葉中含有黃酮類、有機(jī)酸、香豆精類等成分，其中主要包括槲皮素、根皮素、阿魏酸、香莢蘭酸、p-香豆酸、水楊酸、傘形花內(nèi)酯、龍膽酸和o-香豆酸等，大部分以結(jié)合形式存在，少部分物質(zhì)以游離形式存在，例如傘形花內(nèi)酯、阿魏酸和水楊酸等。此外，檸檬葉中還含大量的揮發(fā)油、維生素和葉綠素等［1］。檸檬精油的氣味清新、強(qiáng)烈，淡黃綠色，水質(zhì)粘性，揮發(fā)性好。檸檬葉精油含有多種活性成分，主要為單萜烯類、醇類、醛類化合物。由目前研究可知，檸檬揮發(fā)性成分的開發(fā)利用主要在鮮果果皮精油的提取，檸檬葉中芳香性成分的研究較少，主要集中在提取方法和優(yōu)化提取工藝等方面，例如超臨界 CO2、流體萃?。?］、微波輔助提?。?］、超聲波輔助 提?。?］、超聲波協(xié)同微波提取等［5］；并采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法分析、鑒定檸檬揮發(fā)油成分［6－8］。但是對(duì)檸檬葉精油成分的功能特性研究卻非常少。這些實(shí)驗(yàn)大部分是針對(duì)檸檬果皮的精油提取的而開展的，對(duì)檸檬葉精油的提取的研究少之又少，除了木里檸檬葉精油外，其他鮮有報(bào)道。因此，若能合理開發(fā)利用檸檬葉中所含的有效成分，使大批量的檸檬葉不被當(dāng)成廢棄物扔掉，不僅促進(jìn)檸檬產(chǎn)業(yè)鏈的延伸和發(fā)展，而且能增加檸檬樹的經(jīng)濟(jì)附加值［9］。

本文采用水蒸氣蒸餾法提取檸檬葉精油，分別對(duì)從鮮檸檬葉和干檸檬葉中提取的精油進(jìn)行對(duì)比，以Vc（抗壞血酸）和BHT（2，6-二叔丁基對(duì)甲酚）作為對(duì)照，對(duì)檸檬葉精油和萃取物清除自由基能力、清除亞硝基能力、總還原能力、抑制黃嘌呤氧化酶活性的能力進(jìn)行測(cè)定。對(duì)比評(píng)價(jià)精油與殘?jiān)腿∥锏墓δ苄裕荚跒闄幟嗜~的綜合利用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

鮮檸檬葉、干檸檬葉：購(gòu)自廣州聚鮮林貿(mào)易有限公司，產(chǎn)地廣西；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：日本東京化成株式會(huì)社；黃嘌呤氧化酶：上海源葉生物科技有限公司；黃嘌呤：北京恒業(yè)中遠(yuǎn)化工有限公司；抗壞血酸：天津市博迪化工有限公司；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）：南京信帆生物技術(shù)有限公司；鄰苯三酚：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

W501升降恒溫油浴鍋 上海申勝生物技術(shù)有限公司；HZS-H恒溫水浴振蕩箱 上海晶壇儀器制造有限公司；R-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海道京儀器有限公司；BS210S電子天平 德國(guó)Sartorius儀器公司；UV 5100B型紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；DHG-9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PHS-260型酸度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DC-2006低溫恒溫槽 寧波市海曙天恒儀器廠。

1.2 檸檬精油的提取

分別將干檸檬葉放入搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)中粉碎至粉末狀，將鮮檸檬葉剪至約1cm2的小碎塊，備用。取200g粉碎的干檸檬葉或300g（包括梗）上述剪碎的鮮檸檬葉放入水蒸氣提取裝置的2000mL三口燒瓶中，按照物料比1∶8加入蒸餾水1600mL。安裝水蒸氣蒸餾裝置，打開低溫恒溫槽，將溫度設(shè)置為－4℃開始制冷，等溫度降低至設(shè)定溫度后，打開循環(huán)開關(guān)讓液體在冷凝管內(nèi)循環(huán)起來(lái)，然后加熱油浴鍋。油浴鍋溫度設(shè)定為由80℃逐漸升高，直至沸騰回流，這時(shí)油浴鍋溫度為120℃。蒸餾時(shí)間為3h（以第1滴液體出現(xiàn)開始計(jì)時(shí)）［10，11］。從收集管中的餾出液中冷卻分離出上層精油，裝入密閉精油瓶，放入冰箱中冷卻1夜，用膠頭吸管吸出精油中析出的少量水分，得到無(wú)色透明的精油。

1.3 純化后的檸檬葉精油抗氧化活性研究

1.3.1 清除DPPH自由基活性的測(cè)定

取系列濃度為1，2，3，4，5mg／mL的樣品乙醇溶液、BHT乙醇溶液和抗壞血酸乙醇溶液0.1mL，加入到3.9mL濃度為6×10－5mol／L的 DPPH 乙醇溶液中，28℃下水浴10min，然后迅速在517nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。同時(shí)測(cè)定不加提取物的空白樣品的吸光度值，按公式（1）計(jì)算 DPPH 自由基的清除率（%）［12，13］：

式中：SC1為DPPH自由基的清除率；A樣品為樣品的吸光度值；A空白為空白樣品的吸光度值。

1.3.2 清除羥自由基活性的測(cè)定

精確移取濃度為5mmol／L的鄰二氮菲溶液1.5mL，再加入濃度為50mmol／L pH 7.4的磷酸緩沖溶液2mL，充分混勻，滴加1.0mL濃度為7.5mmol／L的硫酸亞鐵溶液，立即混勻，分別加入1mL各系列濃度為1，2，3，4，5mg／mL的樣品溶液、BHT、抗壞血酸，最后加入1.0mL質(zhì)量濃度為0.1%的H2O2啟動(dòng)反應(yīng)。樣品管用水補(bǔ)體積至10mL，損傷管中加H2O2不加樣品溶液，未損傷管兩者都不加，損傷管和未損傷管都用水補(bǔ)充體積至10mL，將各管均置于37℃水浴中1h，拿出后迅速在波長(zhǎng)536nm處測(cè)定吸光度值［14］。根據(jù)公式（2）計(jì)算羥自由基的清除率：

式中：SC2為羥基自由基的清除率；A0為未損傷管的吸光度值；A1為損傷管的吸光度值；A2為樣品管的吸光度值。

1.3.3 清除超氧陰離子自由基活性的測(cè)定

分別取1mL系列濃度為1，2，3，4，5mg／mL的樣品溶液、BHT溶液、抗壞血酸溶液，加入6mL濃度為50mmol／L的 Tris-HCl（pH 8.2）緩沖溶液，25℃下水浴20min，取出后立即加入0.1mL 25℃下預(yù)熱的10mmol／L鄰苯三酚溶液，精確反應(yīng)4min后，立即加入0.1mL濃度為6mol／L的鹽酸停止反應(yīng)，以蒸餾水為參比溶液，在325nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值［15］。用等體積的10mmol／L鹽酸代替鄰苯三酚調(diào)零，每一個(gè)樣品對(duì)應(yīng)一個(gè)空白。根據(jù)公式（3）計(jì)算超氧陰離子自由基的清除率：

式中：SC3為超氧陰離子自由基的清除率；A0為對(duì)照組的吸光度值；A1為樣品組的吸光度值。

1.3.4 采用重氮偶合比色法測(cè)定清除NO2－活性

分別取0.5mL濃度為1，2，3，4，5mg／mL的樣品溶液、BHT、抗壞血酸樣品液，分別加入1.0mL檸檬酸緩沖溶液（pH 3.0）和1.0mL 濃度為10μg／mL的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，在37℃恒溫水浴中反應(yīng)1h，取出后加入15mL蒸餾水，再加入1mL濃度為4mg／mL的對(duì)氨基苯磺酸溶液，搖勻，靜置5min。加入0.5mL濃度為2mg／mL的鹽酸萘乙二胺溶液，用蒸餾水定容到刻度線，搖勻，靜置15min，在546nm波長(zhǎng)下測(cè)得吸光度值［16］。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出對(duì)應(yīng)的亞硝酸鈉含量，根據(jù)公式（4）計(jì)算超氧陰離子自由基的清除率：

式中：SC4為亞硝酸根自由基的清除率；m1為亞硝酸鈉的加入量，μg；m2為亞硝酸鈉的殘留量，μg。

1.3.5 總還原能力的測(cè)定

分別取1mL濃度為1，2，3，4，5mg／mL的樣品溶液、BHT、抗壞血酸樣品液，加入2.5mL磷酸緩沖溶液（200mmol／L，pH 6.6）以及2.5mL 濃度為1g／dL的鐵氰化鉀溶液，混勻。50℃恒溫水浴20min后，迅速冷卻，加入2.5mL濃度為10g／dL的三氯乙酸溶液，離心。取2.5mL上清液，加入2.5mL蒸餾水和0.5mL濃度為0.1g／dL的三氯化鐵溶液。靜置10min后，在700nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。每個(gè)樣品都做對(duì)應(yīng)的空白背景值測(cè)定（實(shí)驗(yàn)步驟中用蒸餾水代替鐵氰化鉀溶液）。還原能力用抗壞血酸當(dāng)量AEE（ascorbic acid equivalents）表示，單位μg AEE／mL。

1.3.6 抑制黃嘌呤氧化酶活性的測(cè)定方法

精確吸取3.75mL濃度為50mmol／L的磷酸鹽緩沖液加入50mL錐形瓶中，再加3mL 0.15mmol／mL的黃嘌呤溶液，混勻后立即在290nm下測(cè)定吸光度值，記為A0。調(diào)節(jié)水浴振蕩的條件25℃，100r／min，將測(cè)完吸光度值的錐形瓶放入其中反應(yīng)30min，最后加入1.25mL 1mol／L的 HCl終止反應(yīng)，再次測(cè)定吸光度值，記為A30［17］；體系中加入1mL 18mU／mL的黃嘌呤氧化酶，測(cè)定290nm下的吸光度值，按是否終止反應(yīng)分別記為AE0和AE30；體系中加入1mL不同濃度梯度的各樣品溶液，測(cè)定290nm下的吸光度值，按是否終止反應(yīng)分別記為AS0和 AS30；體系中既加入1mL 18mU／mL黃嘌呤氧化酶，又加入1mL各樣品溶液，測(cè)定290nm下的吸光度值，按是否終止反應(yīng)分別記為 A（E＋S）0和 A（E＋S）30（以甲醇為對(duì)照組）。

根據(jù)公式（5）計(jì)算不同濃度梯度的各樣品溶液抑制黃嘌呤氧化酶活性的抑制率：

2 結(jié)果與分析

2.1 清除DPPH自由基的能力

圖1 各濃度樣品清除DPPH自由基能力的變化曲線

由圖1可知，檸檬葉精油在濃度2.0～10.0mg／mL的范圍內(nèi)，對(duì)DPPH自由基的清除率總體呈上升趨勢(shì)（P＜0.05）。Vc的清除率最大達(dá)到90%以上，但趨勢(shì)較為平緩，BHT的增加幅度由急到緩，逐漸趨近Vc；鮮葉精油和干葉精油清除DPPH自由基的能力相較于同濃度的VC和BHT較弱，其中干葉精油清除DPPH自由基的能力比鮮葉精油的清除能力略強(qiáng)，二者上升趨勢(shì)一致；萃取物的清除能力相較于同濃度的VC和BHT較弱，與檸檬精油基本相近。

表1 各樣品清除DPPH自由基的IC50值

由表1中各實(shí)驗(yàn)樣品的IC50值可以直觀地看出所測(cè)試的樣品清除DPPH自由基的能力，各樣品的IC50值差別不大，可表示為：VC＜BHT＜干葉精油＜鮮葉精油?？梢钥闯鯞HT和VC的IC50值較小，清除能力較強(qiáng)，鮮葉精油和干葉精油的IC50值較大，清除效果一般，因此，檸檬葉精油在清除自由基方面均有清除作用，但清除作用相較于VC和BHT較弱。

2.2 清除羥基自由基的能力

圖2 各濃度樣品清除羥基自由基能力的變化曲線

由圖2可知，各樣品在濃度范圍2.0～10.0mg／mL內(nèi)，羥基自由基的清除率大體呈上升趨勢(shì)（P＜0.05）。VC和BHT清除羥基自由基的能力隨著濃度的增大而增大，在濃度最大處，BHT清除率達(dá)到95.29%；相同條件下，鮮葉精油增加幅度較為平緩，與同濃度的干葉精油相比，清除羥基自由基的能力略強(qiáng)；同濃度梯度的檸檬精油的清除能力超過(guò)同濃度下的BHT和VC，其清除能力上升趨勢(shì)緩慢，但在低濃度時(shí)二者就可以明顯地清除羥基自由基，隨著濃度的不斷增加，二者清除率也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。

表2 各樣品清除羥基自由基的IC50值

表2中各實(shí)驗(yàn)樣品的IC50值可以直觀地看出所測(cè)試的樣品清除羥基自由基的能力，各樣品的IC50值差異較大，鮮葉精油＜干葉精油＜BHT＜VC?？梢缘贸?，檸檬精油具有較強(qiáng)的清除羥基自由基能力，清除效果超過(guò)VC和BHT。

2.3 清除超氧陰離子自由基的能力

圖3 各濃度樣品清除超氧陰離子自由基能力的變化曲線

由圖3可知，各樣品在濃度范圍2.0～10.0mg／mL內(nèi)，超氧陰離子自由基的清除率無(wú)規(guī)律，多處出現(xiàn)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，大部分呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)（P＜0.05），VC和BHT清除率在44%～60%之間，清除超氧陰離子自由基的能力一般，但隨著濃度的不斷增大，清除率緩慢上升；鮮葉精油清除超氧陰離子自由基的能力較好，增加幅度較為平緩，且在中間出現(xiàn)最低點(diǎn)；干葉精油在8～10mg／mL時(shí)快速增加，最后超過(guò)VC和BHT；干葉精油和鮮葉精油均在較低濃度時(shí)就有較好的清除率，均超過(guò)同濃度的VC和BHT。

表3 各樣品清除超氧陰離子自由基的IC50值

由表3可知，樣品對(duì)超氧陰離子自由基清除能力的半數(shù)抑制濃度，實(shí)驗(yàn)樣品的IC50值差異不大，鮮葉精油＜BHT＜干葉精油＜VC。

2.4 清除亞硝酸鹽活性的能力

圖4 各濃度樣品清除亞硝酸鹽能力的變化曲線

由圖4可知，鮮葉精油和干葉精油對(duì)亞硝酸鹽的清除能力基本相同，上升趨勢(shì)一致并且都在較低濃度時(shí)就呈現(xiàn)出良好的清除率，但相比VC和BHT，鮮葉精油和干葉精油的清除能力略弱于VC和BHT。

表4 各樣品清除亞硝酸鹽的IC50值

由表4可知，樣品對(duì)亞硝酸鹽清除能力的半數(shù)抑制濃度，實(shí)驗(yàn)樣品的IC50值差異不大，BHT＜VC＜干葉精油＝鮮葉精油。

2.5 總還原能力的測(cè)定

圖5 各濃度樣品總還原能力的變化曲線

由圖5可知，各樣品在濃度范圍2.0～10.0mg／mL內(nèi)，總還原能力總體呈上升趨勢(shì)（P＜0.05），個(gè)別點(diǎn)出現(xiàn)下降。VC的總還原能力較為平緩，BHT的上升幅度大且快速，濃度最大時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)；干葉精油和鮮葉精油總還原能力較弱，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于BHT，二者趨勢(shì)較為平穩(wěn)且一致。發(fā)現(xiàn)檸檬鮮葉精油的清除能力較弱，其原因是檸檬鮮葉精油受pH值的影響較大，反應(yīng)環(huán)境的pH值限制了其抗氧化活性。

2.6 抑制黃嘌呤氧化酶活性的測(cè)定

圖6 各濃度樣品抑制黃嘌呤氧化酶活性曲線

由圖6可知，各樣品在濃度范圍2.0～10.0mg／mL內(nèi)，抑制率曲線變化趨勢(shì)無(wú)規(guī)律，多個(gè)測(cè)定點(diǎn)出現(xiàn)轉(zhuǎn)折（P＜0.05）；VC在較低濃度時(shí)具有較好的抑制黃嘌呤氧化酶作用，隨著濃度的增加而快速降低；BHT抑制黃嘌呤氧化酶的抑制率隨著濃度的增加而增大，濃度越大，上升越緩慢；檸檬鮮葉精油和檸檬干葉精油抑制黃嘌呤氧化酶活性一般，最大抑制率約為45%，二者總體呈上升趨勢(shì)，但個(gè)別點(diǎn)出現(xiàn)異常。因此，檸檬精油具有抑制黃嘌呤氧化酶活性的作用，但活性一般。

2.7 各活性指標(biāo)的相關(guān)性分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，用Pearson進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，以P＜0.05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)各種測(cè)定方法間的相關(guān)程度。檸檬葉精油及其萃取物的抗氧化性評(píng)價(jià)方法的相關(guān)性分析見表5和表6。

表5 干葉精油6種抗氧化性評(píng)價(jià)方法的相關(guān)性

由表5可知，干葉精油的6種測(cè)定抗氧化活性的評(píng)價(jià)方法中，羥基的清除能力與NO－2的清除能力的線性相關(guān)顯著（P＜0.05），其他活性指標(biāo)間相關(guān)程度不明顯。

表6 鮮葉精油6種抗氧化性評(píng)價(jià)方法的相關(guān)性

由表6可知，鮮葉精油的6種測(cè)定抗氧化活性的評(píng)價(jià)方法中，羥基自由基的清除能力與NO2－的清除能力的線性相關(guān)顯著（P＜0.05），總還原能力與NO2－的清除能力的線性相關(guān)非常顯著（P＜0.01），其他活性指標(biāo)間相關(guān)程度不明顯。

3 結(jié)論

采用水蒸氣蒸餾法提取檸檬鮮葉和檸檬干葉中的精油，通過(guò)對(duì)檸檬葉精油清除DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基、亞硝酸鈉、總還原能力以及抑制黃嘌呤氧化酶活性能力的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)檸檬葉精油對(duì)各種自由基的清除效果有差異，鮮葉精油對(duì)羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除能力較強(qiáng)，優(yōu)于BHT和VC。干葉精油和鮮葉精油對(duì)羥基自由基的清除能力與NO2－的清除能力之間相關(guān)關(guān)系顯著（P＜0.05），且鮮葉精油的總還原能力與NO2－的清除能力之間的相關(guān)關(guān)系非常顯著（P＜0.01）。綜上，檸檬葉精油具有較好的抗氧化活性，可對(duì)其活性加以利用。