黑姜抗氧化活性研究

宗寧宇，王春亮，張志國＊，黃珊

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）食品科學(xué)與工程學(xué)院，濟(jì)南 250353；2.山東和盈機(jī)械科技有限公司，山東 諸城 262200）

姜，屬姜科，草本植物姜的根莖，多年生，又名百辣云、因地辛、姜根，其根莖肉質(zhì)肥厚，形狀如掌［1，2］。姜具有辛辣味和濃郁的芳香味，是一種常見的香辛調(diào)味料。姜原產(chǎn)于東南亞熱帶地區(qū)，在我國中部、東南部至西南部各省均有種植，山東萊蕪、湖南新邵、四川宜賓等地均是姜的主要產(chǎn)區(qū)［3，4］。姜是一種藥食兩用植物，研究表明姜具有抗氧化、抗腫瘤、保肝利膽、消炎止痛、降血脂等多種生物活性［5－8］。黑姜，是以新鮮姜為原料，在一定的溫度和濕度的條件下，發(fā)酵而成的一種新型姜制品。其中在加工黑姜的過程中，黑姜自身的組織遭到破壞，其物質(zhì)發(fā)生一系列化學(xué)反應(yīng)，包括酶促反應(yīng)和非酶褐變反應(yīng)，具體如美拉德反應(yīng)、焦糖化反應(yīng)等［9］。黑姜經(jīng)發(fā)酵后，成分和功能上都發(fā)生了一些變化，營養(yǎng)成分和更強(qiáng)的生理活性更加豐富［10］。本文分別對黑姜的抗氧化活性進(jìn)行了研究，通過測定其水提物和醇提物清除DPPH自由基能力、清除ABTS自由基能力、清除OH自由基能力和鐵還原能力，同時以蘆丁為陽性對照，測定了新鮮未經(jīng)處理的姜的醇提物和水提物的抗氧化活性，與黑姜進(jìn)行對比。目前，國內(nèi)外對黑姜的活性研究鮮有報道，本文通過對黑姜的抗氧化活性研究，以期為姜的開發(fā)利用提供一些理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：購自索萊寶生物科技有限公司，DPPH（1-二苯基-2-三硝基苯肼）：購自上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；ABTS（2＇-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）、TPTZ（2，4，6-三吡啶基三嗪）：購自安徽博美生物科技有限公司；無水乙醇：購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 廣州市漢迪環(huán)境試驗設(shè)備有限公司；可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；低速離心機(jī) 張家港市南洋機(jī)械有限公司；水浴鍋 常州中捷實驗儀器制造有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州凱祥儀器設(shè)備有限公司；超聲儀 上海生析超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

分別準(zhǔn)確稱取樣品50g，置于蒸餾水和70%乙醇（料液比為1∶10）中于40℃ 水浴浸提4h后，超聲浸提30min。將浸提液過濾、離心，濾渣按上述方法重復(fù)浸提2次，合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，再通過真空冷凍干燥。干燥后的樣品稱重，并配成所需濃度的樣品液。

1.3.2 DPPH自由基清除實驗

分別取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液1.0mL，依次加入2.0mL 0.1mmol／L的DPPH 乙醇溶液中，暗處室溫反應(yīng)30min，在波長517nm處的吸光度為A1，以無水乙醇溶劑作空白對照，測量其在波長517nm處的吸光度（A0）。測定2.0mL無水乙醇溶液與1.0mL樣品液混合后在波長517nm處的吸光度（A2），以蘆丁作陽性對照，每組做3個重復(fù)，求其平均值［11，12］。

DPPH自由基清除率（%）＝［1－（A1－A2）／A0］×100。

1.3.3 ABTS自由基清除實驗

ABTS自由基溶液的制備：將ABTS和K2S2O8混合，并確保它們的最終濃度分別為7.0，2.5mmol／L，之后將混合液置于室溫暗處反應(yīng)12～16h。實驗之前，將其用pH為7.4的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋，直到稀釋液在波長734nm條件下的吸光度值為0.7左右，制成ABTS自由基工作液。

在試管中加入1.0mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，再加入2.0mL的ABTS自由基工作液，搖勻使其充分混合，在室溫下反應(yīng)6min后，在波長734nm條件下測定其吸光度（A1），以蒸餾水為空白對照測量其吸光度（A0），測定2.0mL磷酸鹽緩沖液，1mL樣品液反應(yīng)，吸光值為A2。以不同質(zhì)量濃度的蘆丁溶液作為陽性對照，每組做3個重復(fù)，求其平均值［13，14］。

ABTS自由基清除率（%）＝［1－（A1－A2）／A0］×100。

1.3.4 OH自由基清除實驗

向試管中分別加入不同質(zhì)量濃度的樣品溶液2.0mL，然后分別加入1.8mmol／L 硫酸亞鐵溶液2.0mL和1.8mmol／L水楊酸-乙醇2.0mL，最后加入雙氧水（0.03%）0.1mL用以啟動反應(yīng)，用振蕩器混合均勻，于37℃水浴保持30min，在波長為510nm下測量各自的吸光度A1，用蒸餾水代替樣品所得到的吸光度為空白對照A0，以無水乙醇代替水楊酸-乙醇溶液的吸光度A2，并用蘆丁代替樣品作陽性對照，每組做3個重復(fù)，求其平均值［15，16］。

清除率（%）＝［1－（A1－A2）／A0］×100。

1.3.5 FRAP（ferric reducing antioxidant power）評估方法

FRAP試劑的制備：300mmol／L醋酸緩沖液（pH 3.6）、10mmol／L TPTZ（加入40mmol／L鹽酸）和20mmol／L FeCl3溶液，按10∶1∶1混合。

取100μL待測樣品，加入3.6mL FRAP試劑、360μL蒸餾水，充分混勻，于37℃水浴反應(yīng)60min后于593nm處測定吸光度，以不同質(zhì)量濃度的蘆丁溶液作為陽性對照，每組做3個重復(fù)，求其平均值［17，18］。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

通過Excel建立數(shù)據(jù)庫，每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)試驗，試驗所得數(shù)據(jù)均為3次試驗的平均值，用Origin 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析與圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPPH自由基清除實驗

DPPH自由基清除實驗是測定體外抗氧化活性最常用的方法。DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazine，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）是一種在氮氮連接鍵上含有不對稱價電子的氮族自由基，它能穩(wěn)定存在，于517nm處有最大吸收值，易于具有氫鍵供體的化合物發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)［19］。

圖1 姜的DPPH自由基清除率結(jié)果Fig.1 DPPH free radical scavenging rates of ginger

由圖1可知，黑姜醇提物清除DPPH自由基的能力最高，其IC50是0.12mg／mL，是鮮姜水提的2倍多。黑姜水提物的IC50是0.21mg／mL，黑姜醇提物的DPPH自由基清除率要高于水提物的清除率。在相同提取條件下，黑姜的DPPH自由基清除率要高于黃姜的清除率。

2.2 ABTS自由基清除實驗

ABTS［2，2′-azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，2，2′-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽］自由基陽離子清除實驗是根據(jù)不同濃度受試物對ABTS自由基陽離子溶液吸光度的影響，測定天然產(chǎn)物對ABTS自由基陽離子的清除能力［20］。

圖2 姜的ABTS自由基清除率結(jié)果Fig.2 ABTS free radical scavenging rates of ginger

由圖2可知，提取物對ABTS自由基的清除能力高于DPPH自由基的清除率，但整體趨勢與DPPH自由基清除率相同。黑姜醇提物的清除能力，其IC50是0.04mg／mL，低于陽性對照蘆丁的清除率，隨著濃度的升高，清除能力增強(qiáng)。鮮姜水提物清除率最低，其IC50是0.23mg／mL。另外，鮮姜醇提物、黑姜水提物的IC50分別是0.09，0.11mg／mL。

2.3 OH自由基清除實驗

OH自由基是生物細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)活性最強(qiáng)的氧族自由基，可由超氧陰離子和過氧化氫在金屬離子的作用下產(chǎn)生，對羥自由基清除能力的測定，通常采用水楊酸競爭捕捉羥自由基的方式進(jìn)行測定［21］。

圖3 姜的OH自由基清除率結(jié)果Fig.3 OH radical scavenging rates of ginger

由圖3可知，相對于ABTS自由基清除率和DPPH自由基清除率，在同等濃度條件下，對OH自由基的清除能力最低，在所測濃度范圍內(nèi)，只有陽性對照蘆丁的清除率達(dá)到50%。黑姜醇提物的清除率最高，當(dāng)樣品濃度為0.5mg／mL時，OH自由基清除率為36.49%，鮮姜水提物在濃度為0.5mg／mL時，清除率為16.09%。

2.4 FRAP評估方法

圖4 姜的二價鐵離子還原力比較結(jié)果Fig.4 Comparison results of ferrous ion reducing power of ginger

FRAP的原理是基于氧化還原反應(yīng)的比色法以非酶抗氧化劑為還原劑，將氧化物質(zhì)還原，從而起到抗氧化的作用。具體是在酸性條件下，F(xiàn)e3＋-TPTZ被抗氧化劑還原成 Fe2＋-TPTZ，F(xiàn)e2＋-TPTZ在593nm 處有強(qiáng)吸收峰［22，23］。

FRAP法測得的吸光度與抗氧化能力呈正相關(guān)，吸光值越低，鐵還原能力越強(qiáng)，抗氧化活性越高。由圖4可知，黑姜醇提物的鐵還原能力最強(qiáng)，鮮姜水提物的鐵還原力最弱，總體趨勢為黑姜醇提物＞黑姜水提物＞鮮姜醇提物＞鮮姜水提物。

3 結(jié)論

綜上所述，黑姜具有良好的抗氧化活性，與新鮮姜相比，抗氧化活性增強(qiáng)。2種不同提取方式所得的樣品抗氧化活性不同，醇提物的抗氧化效果要優(yōu)于水提物的抗氧化活性。4種抗氧化指標(biāo)的大體趨勢相同，其中黑姜醇提DPPH自由基清除率，其IC50是0.12mg／mL，ABTS自由基清除率，其IC50是0.04mg／mL，OH自由基清除率是鮮姜水提物的2倍多，鐵離子還原力是鮮姜水提物的3倍。