三種新疆烤制食品調味料的協同抗氧化活性初探

趙旭，趙艷，劉玉梅，王浩

（新疆大學 化學化工學院，烏魯木齊 830046）

烤制食品盡管香氣誘人，但在加工過程中溫度較高，可能會發生一系列的化學反應，導致維生素、氨基酸、蛋白質的損失或破壞，甚至可能產生亞硝胺、苯并芘等潛在的致癌物［1－3］。香辛料是指一類有芳香和辛香等典型風味的調味料，除具有增強食品香味、防腐抑菌等作用外，香辛料在食品加工中的一些特殊功效逐漸被發現，尤其是其抗氧化活性及抑制或減少肉制品加工過程中的危害物產生的作用更是被廣泛關注［4，5］。研究表明，同樣愛好燒烤食品的地中海地區人群的心腦血管疾病的發病率很低，就與他們飲食中大量攝入香辛料有關［6］。

孜然、洋蔥是新疆特色美食烤羊肉不可或缺的香辛料，而辣椒也是烤羊肉時的重要調味料［7］。孜然（Cuminum cyminumL.），又名枯茗、孜然芹，維吾爾醫藥認為其具有醒腦通脈、降火平肝等功效，能祛寒除濕、理氣開胃、祛風止痛［8，9］。洋蔥的營養成分十分豐富，不僅富含鉀、維生素C、葉酸、鋅、硒及纖維質等營養素，其重要的黃酮類物質——槲皮素和前列腺素A，令洋蔥具有很強的抗氧化作用［10，11］。與其相配伍的辣椒，維生素B、維生素C和葉酸等含量豐富，辣椒素和辣椒堿還具有抗炎及抗氧化作用，對降低心臟病、腫瘤及其他飲食相關的慢性病發病風險有積極的作用［12，13］。

本文擬通過考察上述3種調味料經不同溫度處理后其總酚、總黃酮和清除自由基活性的變化，研究上述調味料間抗氧化活性的協同作用，以揭示它們在抑制烤羊肉加工過程中因高溫燒烤而誘導的一系列不利于健康的反應方面所發生的積極作用。

1 材料與儀器設備

1.1 材料與試劑

孜然、辣椒和新鮮洋蔥：均購自超市購買，其中孜然和辣椒為干品，試驗前粉碎后過40目篩備用；新鮮洋蔥試驗前剝去最外層的干皮，用打漿機攪拌成漿液備用。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazly，簡稱 DPPH）和福林-酚試液：購于Sigma-Aldrich公司；原花青素標準品、沒食子酸和蘆丁：購于中國食品藥品檢定研究院；硫代巴比妥酸（TBA）、三氯乙酸（TCA）、鄰二氮菲、碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、雙氧水、磷酸鹽緩沖溶液、硫酸亞鐵、無水乙醇、甲醇等：均為分析純，購于化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

BS210S型電子天平 德國賽多利斯公司（讀數精度：0.1mg）；電熱恒溫培養箱 北京市永光明醫療儀器廠；UV-5300PC型紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；TGL16G型離心機 上海安亭科學儀器廠。

2 試驗方法

2.1 樣品制備

2.1.1 單組分提取液的制備

準確稱取3.0000g孜然粉（或3.0000g辣椒粉、15.0000g洋蔥漿液）于100mL小燒杯中，置于預升溫的烘箱中，分別于100，120，140，160，180，200℃烘烤20min，取出降至室溫，用移液管準確加入50mL 75%的乙醇，在攪拌下于70℃的水浴中提取20min，然后超聲提取10min。提取完成后，將提取液抽濾，并用75%的乙醇溶液30mL洗滌濾渣，然后轉移至100mL的容量瓶中，抽濾瓶用少量75%的乙醇潤洗后與濾液合并，最后用75%的乙醇溶液定容至刻度，備用。所有試驗均平行處理3次。

2.1.2 兩組分提取液的制備

稱取3.0000g孜然粉和15.0000g洋蔥漿液于100mL小燒杯中，混合均勻，后續烘烤、提取等處理步驟同2.1.1。

2.1.3 三組分提取液的制備

準稱3.0000g孜然粉、3.0000g辣椒粉和15.0000g洋蔥漿液于100mL小燒杯中，混合均勻，后續烘烤、提取等處理步驟同2.1.1。

2.2 抗氧化活性的評價

2.2.1 總黃酮的測定

蘆丁標準曲線的制備：黃酮類化合物在堿性條件下與鋁鹽（三氯化鋁或硝酸鋁）絡合可呈現紅色絡合物，基于此原理可通過測定反應體系在510nm處的吸光度值來確定黃酮的含量［14］。準稱105℃干燥至恒重的蘆丁標準品109.1mg于100mL容量瓶中，加入體積分數為60%的乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，此為標準儲備液。準確移取此標準儲備液10mL于50mL容量瓶中，加入體積分數為30%的乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，此為標準母液（含蘆丁0.218mg／mL）。準確移取上述標準母液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL分別置于25mL容量瓶中，分別加入1mL 5%的NaNO2溶液，并補加30%乙醇至溶液體積均為10mL，避 光 保 存1h。再 分 別 加 入1mL 10% 的Al（NO3）3，混勻，放置6min；再分別加入10mL 1mol／L的NaOH溶液，并用蒸餾水定容至刻度；搖勻后，靜置反應15min。以不加標準樣品的溶液同上述步驟制備參比，在λ＝510nm處測定吸光度值（A510）。以吸光度值對應蘆丁質量濃度進行線性回歸，得到標準曲線。

樣品中總黃酮的測定：將上述步驟中加入的1.0mL標準溶液改為1.0mL樣品溶液，其余測定步驟同上，獲得樣品溶液的吸光度值，根據標準曲線計算樣品中總黃酮的濃度。

總黃酮含量（mg／g）＝測定樣品濃度（mg／L）×提取液體積（L）×稀釋倍數／樣品質量（g）。

2.2.2 總多酚含量的測定

沒食子酸標準曲線的制備：以105℃干燥至恒重的沒食子酸為標準品，采用福林-酚比色法（Folin-Ciocalteu）測定［15］。準稱44.3mg的沒食子酸標準品于100mL容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻，此為標準儲備液。以此溶液分別配制濃度為8.86，17.72，35.44，70.88，88.60，106.32mg／L 的系列標準溶液。分別移取1mL上述系列標準溶液于10mL容量瓶中，依次加入1mL去離子水、0.5mL已用去離子水稀釋2倍的福林-酚試劑，搖勻，靜置5min；再分別加入1.5mL 20%的Na2CO3溶液，用去離子水定容至刻度，混勻后在室溫下避光反應2h。在λ＝760nm處測其吸光度值（A760），以吸光度值對應沒食子酸質量濃度進行線性回歸，得到總多酚測定的標準曲線。

樣品中總多酚的測定：將上述測定步驟中加入的1mL標準溶液改為1mL樣品溶液，即可得到樣品溶液的吸光度值，根據標準曲線可計算樣品中的總多酚含量。

總多酚含量（mg／g）＝測定樣品濃度（mg／L）×提取液體積（L）×稀釋倍數／樣品質量（g）。

2.2.3 總花青素含量的測定

采用直接紫外分光光度法測定。花青素、原花青素類物質在280nm處有特征吸收峰，用已知含量的原花青素作對照品根據標準曲線可計算樣品中原花青素的含量［16］。

原花青素對照品標準曲線的制備：準確稱取原花青素標準品5mg，用75%的乙醇溶解，定容至10mL容量瓶中，此為標準儲備液。準確吸取此標準儲備液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2mL，分別置于10mL容量瓶中，用75%乙醇定容至刻度，搖勻。用石英比色皿在波長280nm下測定其吸光度值，以75%乙醇為參比，得標準曲線。

樣品中總花青素含量的測定：根據樣品提取液的濃度確定在標準曲線線性范圍內的稀釋倍數，取稀釋后的樣品溶液，以75%乙醇為參比，用石英比色皿在波長280nm下測定其吸光度值，根據標準曲線計算測試樣品中原花青素的含量，并換算出樣品中的含量。

樣品總花青素含量（mg／g）＝測定樣品濃度（mg／L）×提取液體積（L）×稀釋倍數／樣品質量（g）。

2.2.4 清除DPPH·自由基活性評價

二苯基苦基苯肼（DPPH）是一種很穩定的以氮為中心的自由基，其甲醇溶液呈深紫色，在517nm處有強吸收，體系中抗氧化物質可將其單電子配對，在517nm處吸收峰會下降或消失，據此可測定樣品對DPPH·的清除效果，評價樣品的抗氧化能力。用甲醇配制成0.04mg／mL的DPPH標準溶液。準確移取1mL質量濃度在0.02～4.00mg／mL的樣品于試管中，加入DPPH溶液3mL，充分混勻，放置40min。在517nm處測其吸光度值A樣。采用1mL甲醇溶液代替上述樣品液，測得空白組的吸光度值A控。實驗中為減少因樣品色差可能帶來的誤差，采用1mL相應的樣品溶于3mL甲醇的溶液作參比A參。DPPH·自由基的清除率計算公式如下：

DPPH·自由基清除率E＝［1－（A樣－A參）／A控］×100%。

2.2.5 清除羥基自由基（·OH 鄰二氮菲-Fe2＋）活性評價

采用鄰二氮菲-二價鐵氧化法。Fenton反應可以使 H2O2－Fe2＋體系產生羥基自由基，H2O2－Fe2＋水溶液被羥基自由基氧化為鄰二氮菲-Fe3＋，反應后其在536nm處的最大吸收峰消失，據此可推算體系中羥基自由基的變化。準稱1.4867g鄰二氮菲，用100mL無水乙醇配制成0.075mol／L鄰二氮菲醇溶液，使用前用重蒸水稀釋100倍。取1mL樣品于20mL試管中，依次加入1mL 0.75mmol／L鄰二氮菲，pH 為7.4的0.2mmol／L磷 酸 鹽 緩 沖 溶 液 2mL，濃 度 為0.75mmol／L FeSO4溶液1mL，充分搖勻，置于37℃保溫箱中保溫1h。取出后冷卻，以重蒸水作空白，測其在536nm波長下的吸光度值A樣。以1mL 0.1%的H2O2代替上述步驟中的1mL樣品，可測得損傷管吸光度值A損；用2mL重蒸水分別代替前述步驟中的1mL樣品和1mL H2O2，可測得未損傷管的吸光度值A未。羥基自由基的清除率計算公式如下：

羥基自由基的清除率E（%）＝［（A樣－ A損）／［A未－A損］×100%。

2.2.6 抑制脂質過氧化活性評價

Fe2＋可誘導脂蛋白發生過氧化反應，使多不飽和脂肪酸（PUFA）氧化為有害產物丙二醛（MDA）［17］。當有硫酸亞鐵存在時，體系中的蛋黃脂質經歷快速非酶過氧化反應，顯色劑硫代巴比妥酸（TBA）與過氧化產物丙二醛MDA的復合物TBA-MDA呈現明顯粉紅色，在532nm處有最大吸收峰，故可用于評價調味料抑制脂質過氧化的能力，通過測定在532nm處吸光值的變化來確定樣品對脂質過氧化的抑制率。準確移取1mL卵黃懸液（1∶25，V／V）到具塞的10mL玻璃試管中，再分別移取1mL 樣液、1mL 25mmol／L FeSO4溶液和1mL pH為4.7的0.1mol／L 磷酸緩沖溶液，培養箱37℃保溫20min，再依次加入1mL TCA、1mL TBA，在532nm處測得吸光度為A樣。將1mL樣液替換成1mL上述磷酸緩沖溶液，測得吸光度為A空白。

脂質過氧化抑制率E＝［（A空白－A樣）／A空白］×100%。

2.2.7 抗氧化協同系數（SE）的計算方法

抗氧化協同系數SE為各體系實驗得到的清除率ESC和理論計算的清除率TSC之間的比值［18］，即SE＝ESC／TSC。當SE＞1時表示有協同作用；當SE＜1時表示無協同作用。

因測試體系的樣品組成不同，理論清除能力（TSC）的計算公式如下：

式中：ESC1，……，ESCn分別是單一樣品清除率的實驗值，n代表體系中組分數量。

2.3 統計分析

所有試驗均采用3次重復，試驗數據的處理及統計分析結果均采用 Microsoft Excel 2010或 Origin Pro 9.0專業軟件來處理，試驗數據均用平均值±標準偏差表示（n≥3）。

3 結果與分析

3.1 標準曲線回歸方程的建立

大量研究表明，多酚和黃酮類物質在自然界分布廣泛，且大多具有非常強的抗氧化活性，是人們自飲食攝入最多的抗氧化物質，總多酚和總黃酮的含量高低與抗氧化活性的強弱有明顯的相關性［19］。測定總黃酮和總多酚的標準曲線見圖1。

圖1 標準曲線及線性回歸方程Fig.1 Standard curves and linear regression equations

3.2 未經烤制樣品分析

新疆烤羊肉加工時，除食鹽外，孜然為必備的調味料。此外多數情況下，羊肉在烤制前會預先伴入洋蔥進行短時間的腌制，而辣椒往往是根據顧客的喜好在烤制后期添加。為了盡可能地模擬上述3種條件，試驗除研究了對上述3種調味料分別單獨進行不同溫度的烘烤外，還分別研究了對孜然和洋蔥的二組分體系和對孜然、辣椒、洋蔥的三組分體系在不同溫度烤制后的總黃酮、總多酚、花青素含量及抗氧化活性隨溫度的變化趨勢，并以未經烤制的樣品作對照。未經烘烤處理的樣品中的各活性成分含量和抗氧化活性的評價結果見表1。

表1 未經烤制樣品的活性成分含量及抗氧化活性Table1 The content of active components and antioxidant activity of unbaked samples

3.3 不同溫度下單組分提取液的總黃酮、總多酚和花青素含量

為了評價烘烤溫度是否會對孜然、洋蔥、辣椒等香辛料中的黃酮、多酚和花青素含量產生影響，在設定的溫度下將樣品單獨烘烤20min后測定了樣品中黃酮、多酚和花青素含量的變化，結果見圖2。

圖2 不同溫度下孜然、洋蔥、辣椒的揮發性成分分析Fig.2 Analysis of volatile constituents of cumin，onion and chili at different temperatures

由圖2可知，經過高溫烘烤處理，對3個樣品中的多酚、黃酮類物質的含量均會產生影響［20］。在3個樣品中，孜然的黃酮、多酚和花青素含量均最高，其次為洋蔥，辣椒中的含量均最低。與表1中未烘烤的樣品相比較，經過不同溫度處理均比未經烘烤的樣品中黃酮、多酚、花青素含量提高，但當溫度升高到160℃或更高時，除洋蔥中的花青素含量外，其他組分樣品的黃酮、多酚和花青素含量隨溫度的升高呈先增大后下降的趨勢。這說明適當的加熱處理后，樣品中的黃酮、多酚和花青素類成分會釋放而更容易被提取。

3.4 單組分清除DPPH·、·OH自由基和抑制脂質過氧化的能力評價

羥基自由基是對細胞損傷最大、反應性最強的活性氧自由基，可對蛋白質、氨基酸、核酸、糖類和脂類等造成氧化損傷，引起細胞突變或壞死［21］。在體外實驗體系中，·OH、DPPH·的清除能力和抑制脂質過氧化的能力是評價體系抗氧化能力強弱的重要方法。由于各樣品的抗氧化活性的濃度差異較大，為了方便比較和評價樣品的協同抗氧化活性，首先通過預試驗確定對應樣品的最適抗氧化體系的濃度范圍，評價抗氧化活性的樣品濃度是以各組分在不同體系中清除率或抑制率達到50%左右時確定的。經不同溫度烘烤處理后的孜然和洋蔥樣品抗氧化活性的評價曲線見圖3。

圖3 不同溫度下孜然、洋蔥和辣椒的抗氧化活性評價Fig.3 Antioxidant activity evaluation of cumin，onion and chili at different temperatures

由圖3中A可知，在清除DPPH·體系中，孜然的清除能力隨溫度增高而上升，在140℃時達到最高值，后隨溫度增高而下降；洋蔥清除DPPH·的能力隨溫度增高緩慢上升，最高值與最低值的變化小于11%；辣椒清除DPPH·能力變化較大，隨溫度增高而上升，在160℃達到最高值，后隨溫度增高而快速下降。由圖3中B和圖3中C可知，在清除·OH體系和抑制脂質過氧化評價體系中，3種調味料的清除能力均隨溫度的增高而上升，當達到最大值后隨溫度的升高而下降，其中孜然、洋蔥清除·OH的能力均在140℃時達到最高，而辣椒在160℃時清除率最大，而孜然、洋蔥和辣椒抑制脂質過氧化的能力分別在180，140，160℃達到最大。結果表明：3種樣品均具有一定的抗氧化活性，這與3種調味料中多酚、黃酮和花青素的含量有關［22］。與未經溫度烤制的樣品相比，DPPH·體系中孜然在較低溫區清除能力較強，溫度大于140℃時其清除能力比未經烤制的樣品低，其余所有體系經溫度處理樣品的抗氧化能力均比未經溫度烤制的樣品高，這與烘烤處理后體系中多酚、黃酮、花青素的含量增加基本一致，說明適當的加熱處理對樣品的活性成分的釋放有利，但溫度過高則不利。

3.5 復配組分的協同抗氧化活性評價

調味料是天然抗氧化劑的豐富來源，因其所含的植物化學物質組成多樣，已在很多食品中除被作為風味調控劑外，也被用作抗氧化劑或抑菌劑，進而發展成為控制食物中脂質過氧化的方法［23］。為了進一步比較上述3種調味料間的協同抗氧化活性，試驗中充分參考了人們在日常飲食中對辣味有不同愛好的特點，比較了孜然、洋蔥二組分調味料混合烘烤和孜然、洋蔥、辣椒三組分調味料混合烘烤時，復配體系樣品中總黃酮、總多酚、花青素含量和清除DPPH·、·OH以及抑制脂質過氧化能力的變化，以評價上述3種調味料是否存在抗氧化活性的協同作用，結果見圖4。

圖4 不同溫度下復配體系的含量及抗氧化活性Fig.4 Composition and antioxidant activity of combined system at different temperatures

由圖4可知，二組分體系中總黃酮、總多酚和花青素含量隨溫度增加的持續上升，在溫度達到200℃時仍未出現含量下降的趨勢；而三組分體系中總黃酮和總多酚均在180℃時達最高，花青素含量則隨溫度的提高在不斷增加。與未經處理的樣品比較，除黃酮外，未經烤制樣品的多酚花青素均比溫度處理后的含量低。在抗氧化評價體系中，除二組分體系清除DPPH·的活性隨溫度的升高持續增加外，其余評價體系中樣品的活性均與三組分體系中總黃酮和總多酚含量的變化趨勢相似，抗氧化活性均在180℃達到最大值。與未經處理的樣品比較，在180℃左右，經溫度處理樣品的抗氧化活性較高，其他溫度區間的抗氧化活性均低于此處理。

3.6 抗氧化協同系數（SE）的計算

為評價2個或2個以上的組分是否存在抗氧化協同作用，協同系數（SE）可用來衡量復合體系協同增效作用的大小。二組分和三組分體系的抗氧化活性的協同系數見表2。

由表2可知，無論是二組分復配和三組分復配體系其協同系數均小于1，即在各種溫度條件下，上述3種調味料均表現為無協同抗氧化作用。未經溫度處理樣品的協同系數也均小于1，故無協同抗氧化作用。

表2 復配體系的協同系數Table2 The synergistic effect（SE）of combined system

4 結論

文章比較了孜然、洋蔥和辣椒3種調味料的單組分、二組分、三組分樣品經不同溫度處理后總黃酮、總多酚和總花青素含量變化，以及清除DPPH·、·OH及抑制脂質過氧化活性的變化，并比較了其抗氧化活性的協同作用。結果表明：孜然的總黃酮、總多酚、總花青素含量最大。經100～200℃烘烤20min后，3種調味料樣品均具有一定程度的清除自由基和抑制抗氧化作用的活性，且孜然、洋蔥二組分復配體系和孜然、洋蔥、辣椒三組分復配體系也均具有抗氧化活性。通過協同系數的計算發現，所有復配體系中均無抗氧化協同作用，且溫度大于180℃時，其抗氧化活性逐漸降低，較適宜的烘烤溫度范圍為140～180℃之間。上述研究可為揭示新疆傳統飲食搭配中的科學問題以及為更好地發展新疆的飲食文化提供借鑒和參考。此外，新疆傳統烤制食品調味料的用量比例、抗氧化機理以及樣品在烘烤前后混合體系中總黃酮、總多酚和花青素含量明顯下降的原因等在后續研究中都還有待深入的探究。