響應(yīng)面酶法輔助超聲提取芫荽總黃酮的工藝研究

劉蕓，胡美忠，任慧婧，莫正昌，郁建生

（1.貴州輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化工系，貴陽(yáng) 550025；2.貴州省中獸藥工程研究中心，貴州 銅仁 554300；3.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 銅仁 554300）

芫荽（Coriandrum sativumL.），一、二年生傘形科草本。辛香升散，可促腸胃蠕動(dòng)，助開(kāi)胃醒脾，又可內(nèi)通心脾外達(dá)四肢，止痛解毒。除了是人們所熟悉的調(diào)味品外，它還具有很高的藥用價(jià)值。芫荽在古代就是調(diào)味和藥用最古老的芳香蔬菜之一［1］，在食品的烹調(diào)和擺盤(pán)中可起到畫(huà)龍點(diǎn)睛的作用，在藥品中的作用也不容小覷。芫荽除了含有平常植物所含有的蛋白質(zhì)、多糖、維生素等成分外，還含有揮發(fā)性油、黃酮等藥用成分，并且揮發(fā)性油、黃酮是芫荽能用于調(diào)味食品及藥用的主要物質(zhì)［2－6］，黃酮還對(duì)植物呈色有一定作用，關(guān)注并研究其有效成分黃酮顯得尤為重要。目前，對(duì)于芫荽揮發(fā)油研究的較多，黃酮、香豆素文獻(xiàn)較少。

植物細(xì)胞擁有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，是阻礙有效成分從植物細(xì)胞中大量溶出的重要因素。細(xì)胞壁的主要成分為纖維素，纖維素可被纖維素酶有效降解。而超聲波提取技術(shù)具有快速、廉價(jià)和高效的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于多種天然產(chǎn)物的提取［7］。現(xiàn)將這兩種技術(shù)聯(lián)用，用適宜的酶和超聲對(duì)植物進(jìn)行處理［8］，繼而再用適宜的有機(jī)溶劑進(jìn)行有效成分的提取。這種方法具有環(huán)保高效、時(shí)間短、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，符合社會(huì)發(fā)展的主流方向［9，10］。目前，王順民等［11］研究了超聲波協(xié)同雙水相體系提取芫荽總黃酮，劉韜等［12］研究了總黃酮的微波提取工藝，劉恒蔚等［13］對(duì)比了香菜的乙醇回流和超聲波輔助提取工藝。本文首次將超聲波法和酶法聯(lián)用應(yīng)用在芫荽的提取中，再通過(guò)響應(yīng)面分析建立數(shù)學(xué)模型，確定最優(yōu)的酶解工藝條件，期待為今后進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用芫荽黃酮甚至改良其調(diào)味效果提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

芫荽（經(jīng)銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院中藥教研室鑒定）：去根洗凈，50℃恒溫干燥，粉碎，過(guò)40目篩；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（100080-201610）：購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；其他試劑：市售，分析純；纖維素酶（酶活力20U／mg）：上海譜振生物科技有限公司。

1.2 儀器

TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Agilent110高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；HMC-WS10純水機(jī) 韓國(guó)Human公司；KQ-500DE臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；HH-6A電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠(chǎng)；pHS-25酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠(chǎng)；WH-861渦旋混合器 上海環(huán)球物化儀器廠(chǎng)；Mettlerae 240十萬(wàn)分之一電子天平 德國(guó)梅特勒-托利多公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠(chǎng)。

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 對(duì)照品溶液的配制

參照方法文獻(xiàn)［2］和文獻(xiàn)［13］的方法進(jìn)行改進(jìn)，精密稱(chēng)定對(duì)照品適量，加30%乙醇溶液溶解并定容至10mL，超聲3min，制得含蘆丁0.25712mg／mL對(duì)照品儲(chǔ)備液Ⅰ。

精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液Ⅰ0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mL配制系列濃度的蘆丁溶液。加5%NaNO20.3mL，渦旋2min，放置5min。加10%Al（NO3）3，渦旋2min，放置6min。加4.0%NaOH 2.0mL，乙醇定容至10mL，渦旋2min，放置15min。在510nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，得蘆丁濃度C與吸光度A的回歸方程，標(biāo)準(zhǔn)回歸方程：C＝10.520A－0.0023，R2＝0.9993。

2.1.2 醇提供試品的制備

參考文獻(xiàn)［12］和文獻(xiàn)［13］的方法進(jìn)行改進(jìn)，芫荽加乙醇濃度70%，液料比25∶1，60℃，350W超聲45min，放冷，收集提取液并濃縮定容至50mL，渦旋3min，過(guò)濾，得醇提供試品儲(chǔ)備液。將儲(chǔ)備液稀釋?zhuān)?.1.1項(xiàng)下條件顯色，即得供試品溶液Ⅱ。

2.1.3 超聲輔助酶解醇提供試品的制備

一定條件（酶用量、酶解pH值、酶解時(shí)間、酶解溫度）下酶解，酶滅活，趁熱過(guò)濾，減壓濃縮。加乙醇達(dá)濃度為70%，60℃，350W 超聲3min，放冷，收集提取液并濃縮70%乙醇定容至50mL，渦旋3min，過(guò)濾，得超聲輔助酶解醇提供試品儲(chǔ)備液。將儲(chǔ)備液稀釋?zhuān)?.1.1項(xiàng)下條件顯色，即得供試品溶液Ⅲ。

2.1.4 液相供試液制備

取蘆丁對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇溶解，微孔濾膜過(guò)濾得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液Ⅳ；取2.1.3供試品儲(chǔ)備液，乙腈定容。離心，上清液微孔濾膜過(guò)濾得芫荽藥材溶液Ⅴ。

2.2 總黃酮收率計(jì)算

參照文獻(xiàn)［2］的方法，總黃酮收率按照下式計(jì)算（以蘆丁計(jì)）：

式中：C為總黃酮濃度，mg／mL；V為提取液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)，M為總質(zhì)量，g。

2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.3.1 酶解溫度

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.5g芫荽粉末，加入15mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，在酶解時(shí)間為20min、酶解pH值為5.0、酶用量為3.0mg／g的條件下，考察不同酶解溫度（35，40，45，50，55℃）對(duì)總黃酮收率的影響。

2.3.2 酶解時(shí)間

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.5g芫荽粉末，加入15mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，在酶解溫度為60℃、酶解pH值為5.0、酶用量為3.0mg／g的條件下，考察不同酶解時(shí)間（5，10，15，20，25min）對(duì)總黃酮收率的影響。

2.3.3 酶解pH 值

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.5g芫荽粉末，加入15mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，在酶解溫度為60℃、酶解時(shí)間為20min、酶用量為3.0mg／g的條件下，考察不同酶解pH 值（4.5，5.0，5.5，6.0，6.5）對(duì)總黃酮收率的影響。

2.3.4 酶用量

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.5g芫荽粉末，加入15mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，在酶解溫度為60℃、酶解時(shí)間為20min、酶解pH值為5.0的條件下，考察不同纖維素酶用量（1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mg／g）對(duì)總黃酮收率的影響。

3 結(jié)果與分析

3.1 高效圖譜檢測(cè)

參考文獻(xiàn)［14］的方法進(jìn)行改進(jìn)，Agilent柱；流動(dòng)相乙腈-0.1%冰醋酸（32∶68），流速1.0mL／min；波長(zhǎng)257nm；進(jìn)樣量10μL；理論踏板數(shù)大于5000，峰形好，見(jiàn)圖1。

圖1 蘆丁對(duì)照品溶液Ⅳ（A）和芫荽藥材溶液Ⅴ（B）HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of rutin reference solutionⅣ（A）and Coriandrum sativummedicinal solution Ⅴ（B）

3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于前期單因素預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，根據(jù)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以蘆丁收率（Y）為響應(yīng)值，在酶解時(shí)間、酶解溫度、酶解pH值、酶用量4個(gè)單因素的基礎(chǔ)上采用4因素3水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素和水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平表Table1 Factors and levels of response surface test design

3.3 酶法輔助超聲提取芫荽中總黃酮的最佳工藝

3.3.1 響應(yīng)面分析及試驗(yàn)結(jié)果

芫荽中總黃酮工藝響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)各因素進(jìn)行回歸擬合，得到二次回歸方程：

Y＝2.19－0.008333A＋0.040B－0.086C－0.046D＋0.022AB＋0.017AC－0.015AD＋0.023BC＋0.005BD－0.0075CD－0.088A2－0.20B2－0.18C2－0.12D2。

利用Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)該回歸模型進(jìn)行分析，結(jié)果表明：該模型達(dá)極顯著水平，失擬項(xiàng)不顯著。模型總決定系數(shù)R2＝0.9915，校正決定系數(shù)R2Adj＝0.9830，R2Pred＝0.9570。表明該模型方程擬合情況較好，該回歸方程能很好地描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，試驗(yàn)方法可靠。該模型可用于超聲輔助酶法提取芫荽中總黃酮的最佳工藝條件。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理Table2 Design and data processing of response surface test

由方差分析結(jié)果中的P值可知：B，C，D，A2，B2，C2，D2均對(duì)總黃酮收率影響極顯著（P＜0.01）。A，AB，BC均對(duì)芫荽中總黃酮收率影響顯著（P＜0.05），模型F＝106.66意味著該模型具有重要意義。以上各因素對(duì)總黃酮收率影響的順序依次為：酶解pH值＞酶用量＞酶解溫度＞酶解時(shí)間。FProb＜0.05，說(shuō)明模型項(xiàng)是顯著的。

根據(jù)回歸模型繪制相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖。各試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系，兩因素之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值影響與響應(yīng)面的陡峭程度成正比，即交互作用對(duì)響應(yīng)值影響強(qiáng)，則曲面越陡峭。反之則平緩，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 兩因素交互作用對(duì)蘆丁得率影響的結(jié)果Fig.2 Response surface of interaction between every two factors on extraction rate of rutin

由圖2可知，酶解時(shí)間和酶解溫度的交互作用、酶解溫度和酶解pH值的交互作用對(duì)總黃酮收率影響顯著。而其他交互項(xiàng)顯著性相對(duì)較差，表明試驗(yàn)因素對(duì)曲面響應(yīng)值是一種非線(xiàn)性的關(guān)系。

3.3.2 總黃酮最佳提取工藝條件的驗(yàn)證

通過(guò)Box-Benhnken分析優(yōu)化，得到纖維素酶輔助超聲提取芫荽總黃酮的最佳工藝條件為：酶解時(shí)間10.35min、酶解溫度49.15℃、酶解pH 值4.89、酶用量1.87mg／g，在該條件下的總黃酮理論收率為2.19mg／g。為方便驗(yàn)證該方法的可行性，采用上述條件的調(diào)整值：酶解時(shí)間10min、酶解溫度49℃、酶解pH 值4.9、酶用量1.9mg／g，對(duì)芫荽中總黃酮進(jìn)行提取。結(jié)果表明：纖維素酶輔助超聲提取芫荽總黃酮平均提取收率（n＝3）為2.15mg／g。試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為0.28%。對(duì)比醇提供試品總黃酮收率1.02mg／g，纖維素酶輔助超聲提取法有效提高芫荽中總黃酮收率達(dá)52.6%。

4 小結(jié)

芫荽是人們喜歡的一種調(diào)味蔬菜，在臨床上也有一定的食療作用［15］，其富含的揮發(fā)性油、總黃酮化合物，引起了食品、醫(yī)藥等行業(yè)的興趣。目前，芫荽總黃酮的提取主要采用乙醇提取法、超聲提取法等。本研究以芫荽總黃酮收率為指標(biāo)，結(jié)果表明纖維素酶輔助超聲提取法相比，比醇提取法芫荽總黃酮收率高52.6%，且大大縮短時(shí)間。相對(duì)酶的各單因素試驗(yàn)結(jié)果而言，經(jīng)過(guò)曲面法優(yōu)化的工藝收率也是最高的。證明采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝方法可靠，本研究?jī)?yōu)選的提取芫荽總黃酮工藝具有提取效率高、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。高效液相色譜定性、定量更直觀，在該實(shí)驗(yàn)中，還對(duì)其測(cè)定蘆丁條件進(jìn)行了摸索和改進(jìn)。綜上所述，本研究可為芫荽的研究及生產(chǎn)提供參考。一個(gè)佳肴的色、香、味離不開(kāi)調(diào)味品，芫荽可以說(shuō)是天然調(diào)味品中的佼佼者，歷史悠久，發(fā)展前景廣闊。