花椒HPLC指紋圖譜建立及指標性成分的測定

張萌萌，李朝敏，吳博，盧烽，吳純潔

（成都中醫藥大學 藥學院，成都 611137）

花椒為蕓香科花椒屬植物花椒（Zanthoxylum bungeanum.Maxim）的干燥成熟果皮，主要分布于四川、甘肅、陜西、河北、河南等地［1，2］。花椒果皮是常用的食品和中藥配料，因其獨特的“麻、香”味而深受人們喜愛，被譽為“八大調味品”之一［3，4］。由于市場上不同品種花椒混種、混收、以次充好，導致市面上的花椒食品質量良莠不齊。GB／T 30391－2013以揮發油含量為依據，將干花椒分為一級（≥3.0mL／100g）、二級（≥2.5mL／100g）2個等級；SB／T 10040－1992以花椒揮發油含量＞2.5%作為花椒的質量控制指標。由此可知，花椒食品的質量控制主要集中于揮發油含量測定方面，缺乏整體評價方法，難以全面反映其內在品質。

指紋圖譜是隨著現代新技術發展而誕生的一種從整體上研究復雜物質體系的技術，已經在中藥質量控制、食品評價、環境保護等領域得到了廣泛應用［5，6］。指紋圖譜技術在食品中的應用，可以對食品品質及其特色成分鑒別提供參考數據。本文采用HPLC技術建立花椒指紋圖譜，采用相似度分析和聚類分析對花椒指紋圖譜進行分析，并進一步對其主要化學成分進行鑒定及含量測定，從而為花椒食品的質量控制提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設備

Shimadzu LC-10A高效液相色譜儀 日本島津公司；Sartorius BP 211D電子天平（十萬分之一） 德國賽多利斯公司；HH-4恒溫水浴鍋 北京中興偉業儀器有限公司；UPT-11-10T優普系列超純水器 四川優普超純科技有限公司；HX-200型高速中藥粉碎機 浙江省永康市溪岸五金藥具廠。

1.2 材料與試劑

16批花椒樣品信息詳情見表1。

表1 16批不同產地花椒樣品Table1 Information of 16samples of Z.bungeanum from different areas

羥基-α，β-山椒素對照品（純度＞98%）：實驗室自制；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：購自Sigma公司；乙醇、甲醇（分析純）：購自成都市科龍化工試劑廠。

2 實驗方法與結果

2.1 指紋圖譜研究

2.1.1 色譜條件

Wondasil C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-水（B）梯度洗脫；流速0.8mL／min；柱溫30℃；檢測波長268nm；進樣量10μL。洗脫程序見表2。

表2 流動相梯度洗脫程序Table2 Gradient elution program of moving phase

續 表

2.1.2 供試品溶液的制備

稱取花椒粉末（過3號篩）約0.5g，精密稱定，置于50mL錐形瓶中，加30倍量50%的乙醇，回流提取30min，取出，放至室溫，過濾；濾渣繼續加20倍量50%的乙醇，回流提取30min，取出，放冷，過濾，合并2次濾液，定容至50mL容量瓶中，經0.22μm的微孔濾膜過濾，即得。

2.1.3 精密度考察

稱取花椒粉末（S1）約0.5g，精密稱定，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件連續進樣6次，以4號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果12個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 重復性考察

稱取花椒粉末（S1）6份，每份約0.5g，精密稱定，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進行測定分析，以4號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果12個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3%，表明此方法重復性好，適合花椒指紋圖譜的研究。

2.1.5 穩定性考察

稱取花椒粉末（S1）約0.5g，精密稱定，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件分別于0，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0h測定峰面積，以4號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果12個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3%，表明花椒供試品溶液在8h穩定。

2.1.6 指紋圖譜的建立［7］

稱取16批花椒粉末各約0.5g，精密稱定，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣，記錄各樣品色譜圖，得到16批花椒樣品的指紋圖譜，見圖1。將其導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2004A版），以表3中S3為參照圖譜，時間寬度設定為0.10，多點校正后，進行分析，生成花椒共有模式對照指紋圖譜，標定12個峰，見圖2。各批次樣品色譜圖與對照指紋圖譜相似度結果見表3。

圖1 16批花椒樣品指紋圖譜疊加圖Fig.1 Overlay chart of HPLC fingerprint of 16batches of Z.bungeanum

圖2 花椒對照指紋圖譜Fig.2 Reference fingerprint of Z.bungeanum

表3 16批花椒對照指紋圖譜相似度Table3 Similarity of HPLC fingerprint of 16batches of Z.bungeanum

由表3可知，16批花椒樣品的相似度較好，均大于0.90，表明各產地的花椒質量具有較高的一致性。

2.1.7 聚類分析［8］

聚類分析是一種無指導、探索性的模式識別方法，以所得樣品的色譜指紋圖譜為特征，對樣品進行分類。本研究應用SPSS軟件，將各色譜峰占總色譜峰的峰面積進行量化，利用 Word法，以平方Euclidean Distance為測量度對花椒樣品進行聚類分析，見圖3。

圖3 16批花椒樣品聚類分析樹狀圖Fig.3 Dendrogram for 16batches of Z.bungeanum

由圖3可知，當類間距離為20時，16批花椒樣品被分為2大類：S1，S12，S14，S16聚集為一類；S2～S11，S13，S15聚集為一類。當類間距離為10時，16批花椒樣品被分為3大類：S2～S11，S13，S15聚為一類；S1，S12，S14聚為一類；S16單獨為一類。同一產地的花椒樣品相似度較好，但是亦被聚類分析劃分為不同的類別，說明同一產地花椒既具有一致性也存在一定的差異。

2.2 樣品成分含量的測定

2.2.1 色譜條件

Wondasil C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-水（B）為40∶60；流速1.0mL／min；柱溫30℃；檢測波長270nm；進樣量10μL。

2.2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取羥基-α，β-山椒素對照品適量，加甲醇制成濃度分別為120，160μg／mL的混合對照品儲備液，4℃保存，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備

精密稱取花椒粉末（過3號篩）約0.5g，置于50mL的具塞試管中，加30倍量甲醇，連續超聲提取2次，每次60min，過濾，合并2次濾液，定容至50mL容量瓶中，經0.22μm的微孔濾膜過濾，即得。

2.2.4 線性關系考察

分別精密吸取混合對照品儲備液0.25，0.625，1.25，2.0，2.5mL于5mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得系列混合對照品溶液。精密吸取系列對照品溶液10μL，注入液相色譜儀，并記錄峰面積。分別以濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，得羥基-α-山 椒 素、羥 基-β-山 椒 素 的 回 歸 方 程 分 別 為Y＝79234X＋12078（R2＝0.9994）、Y＝71625X－12760（R2＝0.9993），線性范圍分別在6～60μg／mL，8～80μg／mL。

2.2.5 精密度試驗

精密吸取羥基-α，β-山椒素混合對照品溶液10μL，連續進樣6次，測定峰面積。羥基-α，β-山椒素峰面積的RSD值分別為1.26%，1.12%，表明該儀器精密度良好。

2.2.6 重復性試驗

稱取花椒粉末6份，每份0.5g，精密稱定，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進行測定分析。供試品溶液中羥基-α，β-山椒素峰面積的RSD值分別為1.98%，1.76%，表明該方法重復性良好。

2.2.7 穩定性試驗

稱取花椒粉末約0.5g，精密稱定，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件分別于0，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0h測定峰面積。供試品溶液中羥基-α，β-山椒素峰面積的 RSD值分別為2.15%，1.58%，表明供試品溶液在8h內穩定性良好。

2.2.8 加樣回收試驗

精密稱取已知含量的花椒粉末0.5g，共6份，精密加入質量濃度分別為48，64μg／mL的羥基-α，β-山椒素混合對照品溶液30mL，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進行測定。羥基-α，β-山椒素的平均回收率分別為95.02%，97.43%；RSD值分別為2.65%，2.54%，表明該方法準確度較好。

2.2.9 含量的測定

稱取花椒粉末約0.5g，精密稱定，按照2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進行測定，計算花椒中主要成分羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素的含量，色譜圖見圖4，結果見表4。

圖4 混合對照品（A）和花椒（B）HPLC圖Fig.4 HPLC of reference substances（A）and Z.bungeanum（B）

表4 花椒各主要成分含量測定結果Table4 Determination of content of main components in Z.bungeanum%

續 表

不同產地16批次花椒樣品的2個主要成分羥基-α-山椒素的含量在0.323%～1.570%，羥基-β-山椒素的含量在0.03%～0.622%，含量總和在0.440%～2.179%，其中以四川鹽源、漢源含量最高，陜西韓城含量最低，說明不同產地花椒的主要成分羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素質量分數差異較大。

3 討論

本研究考察了提取方法（超聲、回流、冷浸）、提取溶劑（水、50%乙醇、乙醇）、提取時間（15，30，60min）、流動相（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%三乙胺）、波長（220，254，268nm）、柱溫（25，30，35 ℃）、流速（0.8，1.0，1.2mL／min），結果表明：采用50%乙醇回流提取30min時，提取較完全，雜質少，分離效果較好；流動相為乙腈-水，梯度洗脫，檢測波長268nm，柱溫30℃，流量0.8mL／min時，所得圖譜的分離效果、基線、峰形等均較好，色譜信息豐富。

本研究建立了16批不同產地花椒HPLC指紋圖譜，共標定12個共有峰，并利用相似度評價和聚類分析對花椒HPLC指紋圖譜進行研究。16批花椒樣品的相似度均大于0.9，表明不同產地的花椒樣品質量較好；當類間距離為10時，16批花椒樣品被分為3大類：S2，S3，S4～S11，S13，S15聚為一類；S1，S12，S14聚為一類；S16單獨為一類。花椒中主要成分羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素的含量總和在0.440%～2.179%。通過分析，發現同一產地花椒指紋圖譜的相似度及分類亦有一定的差異，如陜西韓城花椒相似度在0.904～0.935，其主要成分的含量在0.440%～0.821%，兩者跨度均較大，可能是由于采收季節的不同或栽培管理方式的不一致造成的，同時進一步說明本研究建立的花椒指紋圖譜用于花椒食品質量控制具有積極的意義。

食品質量控制是保證食品安全、營養的關鍵環節，但是目前食品質量控制大多是通過感官評價或單一成分的含量測定來分析食品的風味及質量［9］，該評價方法單一且不能全面反映其內在品質。本研究建立了多個指標成分結合指紋圖譜來控制花椒食品質量的方法，彌補了單一揮發油指標控制花椒食品質量的缺陷，同時對花椒食品質量安全標準的建立具有重要意義。