麻醉藥物防治脊髓缺血再灌注損傷的動物實驗研究進展▲

樊曉娜 劉 嬌 王黔艷 張雙霜 胡 霽

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院麻醉科，湖北省武漢市 430077，電子郵箱：fxn8023@163.com)

【提要】 脊髓缺血再灌注損傷因其發(fā)生機制復(fù)雜、病情嚴重后果而被廣泛重視。近年來，麻醉藥物對器官的保護作用成為學(xué)者關(guān)注及研究的熱點，其可通過抗炎、抗氧化、抗凋亡、調(diào)節(jié)自噬水平及維持血脊髓屏障完整等多種機制，減輕脊髓缺血再灌注后運動神經(jīng)元損傷。本文就常用麻醉藥物對脊髓缺血再灌注損傷動物的防治效果、劑量及機制等做一綜述。

截癱或者下肢輕癱是外科手術(shù)術(shù)后嚴重并發(fā)癥，盡管外科手術(shù)技術(shù)不斷發(fā)展，但是手術(shù)后脊髓損傷發(fā)生率仍高達32%[1]。發(fā)生脊髓損傷的主要原因是術(shù)中臨時阻斷胸腹主動脈導(dǎo)致脊髓缺血，此后血流再恢復(fù)可能導(dǎo)致?lián)p傷加重，這種效應(yīng)稱為脊髓缺血再灌注損傷(spinal cord ischemia-reperfusion injury，SCIRI)。缺血再灌注可啟動復(fù)雜的交互級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)過氧化、細胞凋亡、鈣超載等多種病理過程，導(dǎo)致細胞和組織環(huán)境改變、血脊髓屏障功能破壞[2-3]。亞致死劑量的缺血預(yù)處理或后處理已被證實可用于實驗動物主動脈阻斷后的脊髓保護[4-5]，但其安全范圍和風(fēng)險仍存在爭議。因此，能夠替代缺血處理、發(fā)揮類似神經(jīng)保護作用的有效藥物具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。近年來，麻醉藥物的器官保護作用愈加得到重視。本文對麻醉藥物在SCIRI動物實驗中應(yīng)用的研究進展做一綜述，旨在為臨床研究提供新的思路。

1 靜脈麻醉藥物在SCIRI動物實驗中的應(yīng)用研究

右美托咪定是一種α2腎上腺素受體激動劑，其對脊髓的保護作用在體內(nèi)及體外SCIRI動物模型中均已得到證實[6-8]。研究表明，于缺血前1 h或30 min給予右美托咪定以10 μg/(kg·h)的速率靜脈輸注，能有效減輕兔脊髓損傷[9-10]。于缺血前1 h或再灌注即刻以5 μg/(kg·h)的速率靜脈輸注右美托咪定可明顯改善SCIRI大鼠的后肢神經(jīng)功能[11]。Goyagi等[12]研究發(fā)現(xiàn)，從脊髓缺血前30 min到再灌注后48 h，分別以0.1 μg/(kg·h)、1 μg/(kg·h)及10 μg/(kg·h)的速率靜脈持續(xù)輸注右美托咪定，均可改善大鼠的神經(jīng)功能和組織學(xué)結(jié)果，效果呈非劑量依賴性。此外，于缺血前鞘內(nèi)注射(L5～L6)右美托咪定(1 μg/kg)，同樣能改善大鼠脊髓組織損傷[13]，但這種給藥方式的相關(guān)研究較少。

丙泊酚是臨床常用的靜脈麻醉藥，動物實驗研究表明其對SCIRI也具有一定防治作用。缺血前10 min及再灌注即刻，將丙泊酚(30 mg/kg)稀釋于30 mL 0.9%氯化鈉溶液中，以3 mL/min的速率靜脈輸注，可有效減輕SCIRI兔的脊髓損傷[14-15]。曾俊等[16]研究結(jié)果顯示，在SCIRI兔模型中采用主動脈內(nèi)灌注丙泊酚也具有脊髓保護效應(yīng)，并且這種保護作用在30 mg/kg到50 mg/kg之間呈劑量依賴性，50 mg/kg效果最佳。與右美托咪定類似，在脊髓缺血前1 h，通過鞘內(nèi)注射的方式給予SCIRI大鼠丙泊酚(100 μg或300 μg)，同樣能減輕脊髓損傷后的組織病理學(xué)改變[17]。

因此，靜脈輸注右美托咪定或丙泊酚有可能可以作為一種有效的脊髓保護措施應(yīng)用于臨床，但其劑量及安全性尚需要進一步研究探討。鞘內(nèi)注射靜脈麻醉藥物保護缺血脊髓神經(jīng)的有效性需要更深入的臨床前研究去證實。

2 吸入性麻醉藥物在SCIRI動物實驗中的應(yīng)用研究

陳瓊等[18]于脊髓缺血再灌注前5 min給予家兔吸入七氟烷[0.5肺泡最小有效濃度(minimum alveolar concentration，MAC)、1.0 MAC和1.5 MAC]10 min，結(jié)果顯示，1.0 MAC七氟烷對于脊髓的保護作用最強，而當(dāng)其濃度增加到1.5 MAC時，再灌注早期血流動力學(xué)變化明顯，保護作用減弱。Wang等[19]的研究結(jié)果也證實于再灌注即刻持續(xù)吸入1.0 MAC七氟烷10 min，可對兔脊髓起到保護作用。Ding等[20]在脊髓缺血前1 h用3.7%七氟烷預(yù)處理家兔30 min，結(jié)果顯示其脊髓運動神經(jīng)元存活率增加，神經(jīng)功能改善。還有研究發(fā)現(xiàn)，在脊髓缺血前2 h，采用2.4%～2.7%濃度的七氟烷預(yù)處理大鼠1 h能減輕其脊髓損傷[21]。值得注意的是，當(dāng)預(yù)處理時間提前到脊髓缺血前24 h，吸入3.4%七氟烷2 h同樣觀察到類似的神經(jīng)保護效應(yīng)[22]。因此，七氟烷對脊髓的保護作用可能具有即刻效應(yīng)以及延遲效應(yīng)。

研究顯示，異氟烷對脊髓神經(jīng)元的保護作用同樣具有延遲效應(yīng)。在脊髓缺血前24 h，采用2.8%濃度異氟烷預(yù)處理大鼠30 min，可提高大鼠的缺血耐受力[23]。此外，在脊髓缺血前5 d，給予大鼠重復(fù)吸入1.4%異氟醚(1 h/d)，也可以保護脊髓組織[24]。吸入性麻醉藥物所誘導(dǎo)的延遲性脊髓缺血耐受是一個重要發(fā)現(xiàn)，其相關(guān)機制可能是未來研究的一個方向。

3 麻醉藥物防治SCIRI的作用機制

3.1 抗炎作用 SCIRI后過度放大的炎癥反應(yīng)是產(chǎn)生二次損傷并造成遲發(fā)性截癱的重要因素[25-26]。高遷移率族蛋白-1作為無菌炎癥的早期介質(zhì)，與Toll樣受體4相互作用，可激活下游信號分子核因子κB(nuclear factor kappaB,NF-κB)，調(diào)節(jié)促炎基因如白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)等轉(zhuǎn)錄，在神經(jīng)系統(tǒng)損傷性應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[10，27-28]。SCIRI過程中NF-κB被高度激活，而右美托咪定可通過抑制其信號通路，減少下游炎性因子的產(chǎn)生，抑制炎癥反應(yīng)并保護缺血脊髓[10]。丙泊酚對脊髓的保護作用同樣與抑制NF-κB信號通路有關(guān)[16]。但是Kim等[23]研究發(fā)現(xiàn)，異氟烷可能通過增加NF-κB的表達，從而發(fā)揮對缺血脊髓的保護作用。因此，NF-κB信號通路的激活或是抑制對SCIRI的調(diào)節(jié)作用，是否與病理過程或脊髓損傷程度不同有關(guān)，目前仍存在爭議，如何通過對NF-κB信號通路及其上下游信號分子進行調(diào)節(jié)以達到抗脊髓損傷的目的，可能是未來研究的關(guān)注點。

此外，脊髓損傷可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞形態(tài)、基因表達和功能行為的快速變化[29]。右美托咪定及七氟烷可通過抑制小膠質(zhì)細胞的活化，減少基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotein，MMP)-9、CXC類趨化因子配體10、CC類趨化因子配體2和炎性因子(IL-1β、TNF-α和 IL-6)的表達，減輕再灌注損傷[8，21]。研究表明，右美托咪定的抗炎作用還與其穩(wěn)定肥大細胞膜，減少促炎因子釋放有關(guān)[30]。

3.2 抗氧化作用 活性氧在缺血再灌注血流恢復(fù)后初期大量產(chǎn)生，是致死性損傷發(fā)生的重要因素之一。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)能有效清除活性氧，減輕組織細胞的損傷。研究表明，丙泊酚的神經(jīng)保護機制與上調(diào)脊髓組織內(nèi)SOD1活性有關(guān)[14]。然而Song等[31]研究發(fā)現(xiàn)，脊髓缺血再灌注10 min內(nèi)，活性氧的產(chǎn)生反而有助于抵抗損傷。七氟烷也可促使適量的活性氧釋放，而釋放的活性氧可能作為信號分子通過激活相關(guān)信號通路增加過氧化氫酶及SOD的活性，保護脊髓免受缺血再灌注損傷[18-19]。因此，在SCIRI中，活性氧的產(chǎn)生可能扮演著“雙刃劍”的角色，一方面其大量產(chǎn)生與急劇堆積可造成細胞及組織的損傷；另一方面，早期適度增高的活性氧可能刺激組織抗傷害性信號通路的活化，從而產(chǎn)生保護效應(yīng)。在活性氧爆發(fā)性損傷產(chǎn)生之前，通過調(diào)節(jié)其生成以增強機體抗氧化系統(tǒng)活性、抵抗致死性損傷，將可能作為一種有效的神經(jīng)保護策略應(yīng)用于臨床。

3.3 抗凋亡作用 神經(jīng)細胞凋亡被認為是導(dǎo)致遲發(fā)性截癱發(fā)生的重要機制。Freeman等[7]通過模擬缺血再灌注損傷發(fā)現(xiàn)，在死亡的神經(jīng)細胞中大部分為凋亡神經(jīng)元。因此，各種抗凋亡策略可被用于降低截癱的發(fā)生率。當(dāng)接受不同的凋亡刺激時，抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma 2，Bcl-2)和促凋亡蛋白Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)相互作用，抑制或激活線粒體外膜通透性(mitochondrial outer membrane permeability，MOMP)。MOMP的發(fā)生導(dǎo)致位于線粒體膜間隙的細胞色素c、線粒體衍生的第二種半胱天冬酶激活劑等釋放到細胞質(zhì)中，引發(fā)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致主要的效應(yīng)因子Caspase-3等激活，造成大量的蛋白發(fā)生水解[32]。右美托咪定對脊髓的保護作用與其調(diào)節(jié)凋亡蛋白表達有關(guān)[11]，但是其上游機制未明。在離體培養(yǎng)的脊髓神經(jīng)元中，右美托咪定可能通過激活磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K-Akt)通路，減少神經(jīng)元細胞凋亡[7]。因此，在缺血再灌注損傷中，右美托咪定對凋亡的調(diào)節(jié)機制可能與其作用于PI3K-Akt-Bcl-2/Bax信號通路有關(guān)。七氟烷對神經(jīng)元凋亡的抑制作用與其上調(diào)脊髓內(nèi)磷酸化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶水平有關(guān)[20]，但其下游效應(yīng)機制尚需進一步研究探討。

3.4 自噬調(diào)節(jié)作用 神經(jīng)系統(tǒng)的損傷可激活自噬，而自噬可能通過某種機制促進其功能恢復(fù)。抗凋亡蛋白Bcl-2可與自噬體成核關(guān)鍵平臺分子Beclin-1的BH3結(jié)構(gòu)域相結(jié)合并影響其活性，阻止Beclin-1組裝前自噬體結(jié)構(gòu)[33]。Fan等[34]研究發(fā)現(xiàn)，脊髓缺血后，Bcl-2的磷酸化破壞了脊髓神經(jīng)元Bcl-2/Beclin-1復(fù)合物的形成，從而增強自噬。自噬主要發(fā)生在再灌注早期(6 h內(nèi))，而缺血預(yù)處理能夠增強和維持自噬水平到再灌注后12 h，認為自噬是一種對缺血的保護性反應(yīng)。曹寧等[22]于再灌注后24 h取大鼠脊髓組織進行檢測，發(fā)現(xiàn)七氟烷預(yù)處理對缺血脊髓的保護機制可能與抑制自噬/溶酶體途徑有關(guān)。因此，缺血再灌注誘導(dǎo)的自噬活性反映了細胞死亡和細胞保護機制的激活，但其作用可能取決于組織以及損傷的性質(zhì)。早期激活的自噬可能通過抑制細胞凋亡和炎癥從而減輕SCIRI，但隨后過度的自噬通過誘導(dǎo)自噬性細胞死亡加重SCIRI。因此，在SCIRI過程中，如何調(diào)節(jié)自噬以達到抗損傷的目的是未來研究的重點。此外，自噬與凋亡蛋白Bcl-2可能是防治SCIRI的一個重要靶點。

3.5 其他機制

3.5.1 血脊髓屏障及神經(jīng)營養(yǎng)因子：血脊髓屏障是血液循環(huán)和脊髓組織之間的生理和代謝物質(zhì)擴散的屏障，其結(jié)構(gòu)完整有助于維持脊髓微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。脊髓損傷后，MMP-9的上調(diào)引起血脊髓屏障的重要成分(緊密連接分子)發(fā)生降解，導(dǎo)致血脊髓屏障破裂和出血，引發(fā)繼發(fā)性損傷級聯(lián)反應(yīng)。丙泊酚及右美托咪定均可通過降低MMP-9的表達，以維持血脊髓屏障的完整性[13，15]。此外，右美托咪定可增強血管生成素1/酪氨酸激酶受體系統(tǒng)，通過防止微血管滲漏，保護血脊髓屏障[13]。

研究表明，右美托咪定還可通過增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)的產(chǎn)量，提高神經(jīng)元的缺血耐受[6，35]。GDNF在給藥24 h后濃度達到最高值，提示可能需要在手術(shù)前1 d應(yīng)用右美托咪定，以最大限度地提高缺血再灌注損傷時脊髓的GDNF濃度。除了GDNF，可能還有其他由星形膠質(zhì)細胞分泌的物質(zhì)保護神經(jīng)元。因此，通過共同培養(yǎng)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞，以進一步模擬運動神經(jīng)元在脊髓中被包圍的真實微環(huán)境是未來研究的另一個方向。

3.5.2 相關(guān)鉀離子通道：雙孔鉀離子通道是一種可被高度調(diào)節(jié)的背景鉀通道超家族，也被稱為“背景”或“基線”鉀通道。它們在整個電壓范圍內(nèi)包括靜息膜電位上是開放的，有助于重構(gòu)去極化對細胞的作用[36]。TWIK相關(guān)鉀離子通道1(TWIK-related K+channel 1，TREK1)作為超家族成員之一，在腦組織和脊髓中高度表達，已經(jīng)被證明可被一定濃度的揮發(fā)性麻醉劑激活[24，37]。研究表明，異氟烷能夠顯著增加缺血脊髓組織中TREK1的表達，通過降低Caspase-3活性，減少亞G1細胞的比例，抑制神經(jīng)元凋亡[38]。因此，對TREK1的表達進行調(diào)控可能是異氟烷保護脊髓免受缺血再灌注損傷的重要機制。

4 小結(jié)與展望

麻醉藥物對缺血脊髓的保護作用在動物實驗研究中已得到證實。然而，現(xiàn)有的大多數(shù)研究只評估了一周內(nèi)的短期效果，而且動物實驗?zāi)Ｐ筒⒉荒芡耆佻F(xiàn)臨床中病理生理變化的復(fù)雜性，因模型差異而導(dǎo)致觀察到的神經(jīng)保護作用所需的麻醉藥物閾值劑量也會不同。因此，在設(shè)計動物實驗時應(yīng)嚴格控制變量，以探索麻醉藥物神經(jīng)保護效應(yīng)是否存在劑量依賴性。上述麻醉藥物通過各種效應(yīng)機制減輕SCIRI，對這些機制的研究有助于深入了解SCIRI產(chǎn)生的原因，并為防治SCIRI提供新策略。