樣本檢前保存條件對幽門螺桿菌培養結果影響

單 宇，魯雯嫻，廖雨琴，祝宇翀，劉軍權

(杭州金域醫學檢驗所有限公司，浙江杭州 310053)

幽門螺桿菌是胃炎、消化性潰瘍和胃癌的重要致病因子[1-2]。目前，臨床對幽門螺桿菌感染治療大多是經驗用藥，隨著感染人群中幽門螺桿菌耐藥菌株的不斷增加，經驗性用藥治療失敗率越來越高。為指導Ⅰ期臨床用藥，提高幽門螺桿菌治療精準性、敏感性，迫切需要實驗室提供幽門螺桿菌培養和藥敏結果。由于幽門螺桿菌需要在微需氧的特殊環境和較高營養條件生長，實驗室培養成功率較低，使得許多醫院都不愿開展幽門螺桿菌培養。近幾年來國內許多第三方醫學檢驗機構針對臨床需求，紛紛開展幽門螺桿菌培養和差異化服務。第三方醫學檢驗為了資源共享，大多將周邊區域的幽門螺桿菌培養樣本集中送往中心實驗室檢測，這勢必會因標本運輸時限，使采集的樣本不能及時送檢或接種，致使幽門螺桿菌自然死亡率增高，降低了幽門螺桿菌培養成功率，影響臨床抗幽門螺桿菌用藥選擇。為觀察樣本貯存時間、溫度和運輸工具對幽門螺桿菌培養結果的影響，本研究將樣本貯存在不同溫度下，并以差異化時間接種培養幽門螺桿菌樣本，以了解條件的改變對幽門螺桿菌培養結果的影響。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑

1.1.1培養液種類 幽門螺桿菌轉運培養基(固-液雙相)購自珠海經濟特區益民生物工程制品廠(批號：20180730)；血瓊脂平板購自鄭州安圖生物工程股份有限公司(批號：20180726B)；苛養菌藥敏瓊脂平板購自鄭州安圖生物工程股份有限公司(批號：20180719B)。

1.1.2鑒定試劑 VITEK MS-CHCA 基質購自生物梅里埃公司(批號：1006062980)；尿素酶購自杭州濱和微生物試劑有限公司(批號：170103)；觸酶和氧化酶購自重慶龐通醫療器械有限公司(批號分別為：18D0804和18D1805)。

1.1.3儀器 梅里埃質譜儀VITEK MS購自生物梅里埃公司；TDR-Y100型微需氧培養儀和微需氧培養氣體(10%二氧化碳+10%氫氣+氮氣平衡氣)購自湖南長沙天地人生物科技有限公司；標本運輸箱購自廣州賽信冷鏈冷藏科技有限公司；D-1-70型自動控制壓力蒸汽滅菌器購自北京發恩科貿有限公司；HSX-250型電熱恒溫恒濕箱購自中儀國科(北京)科技有限公司；DW-86L338型-80 ℃超低溫保存箱購自青島海爾特種電器有限公司；DW-YW166A型-25 ℃冰箱購自中科美菱低溫科技有限責任公司；DW-YL450型4 ℃冰箱購自中科美菱低溫科技有限責任公司；BSC-1500IIB2-X型生物安全柜購自山東濟南鑫貝西生物技術有限公司；CX21FS1C型生物顯微鏡和BX43F型攝像顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.2方法

1.2.1樣本制備 原代幽門螺桿菌標準菌株ATCC43504以TSB基質配制濃度為0.5麥氏濁度的菌懸浮液(約1×108CFU/mL)。按以下步驟進行連續稀釋，(1)1∶00稀釋：吸取上述細菌懸液0.1 mL加入9.9 mL TSB中。(2)再1∶100稀釋：吸經(1)稀釋后懸液0.1 mL加入9.9 mL TSB中。(3)再1∶100稀釋：吸經(2)稀釋后懸液0.1 mL加入9.9 mL TSB中。此時幽門螺桿菌濃度為(100±10)CFU/mL，然后將此濃度的幽門螺桿菌菌液加入運輸培養基中，每支1 mL，共75支。此試驗重復3次。

1.2.2樣本包裝 將標本放置于特殊包裝箱中。包裝箱必須具備，(1)主容器用足量的吸附性材料進行包裹，以便在發生滲漏時可以吸收所有液體。(2)中層包裝，為第2層耐用、水密性、防滲漏的包裝，把主容器裝入其中并對其起保護作用。(3)外包裝，中層包裝置于外包裝內，并加墊適宜的緩沖材料。外包裝應能保護其內容物在運輸時不受外界的影響，如遭受物理性損壞。外層容器的最小一面的尺寸≥10 cm×10 cm。將制備完成的樣本放置于特殊包裝箱中進行相關貯存試驗。

1.2.3樣本貯存 把已接種菌液的幽門螺桿菌運輸培養基分別置于4、25、35、-25、-80 ℃環境中，分別存放6.0、12.0、24.0、48.0 h后進行微需氧培養。

1.2.4樣本的運輸 汽車運輸：將標本置于4 ℃冷鏈運輸箱由本公司冷鏈運輸車運送至杭州金域醫學檢驗所樣本接收組，并及時遞交至微生物室，所有樣本存放總時間為7.0 h后接種。在車上時間為6.0 h。火車運輸：將標本置于4 ℃冷鏈運輸箱，通過安檢并進行交接登記。當日上午約9:00從杭州托遠，至下午15：00左右樣本到達廣州高鐵站，由廣州運務組提貨，在16：00前交接進入廣州金域標本組并及時遞交至微生物室，所有樣本存放總時間為7.0 h后接種，在車上時間約為6.0 h。飛機運輸：將標本置于4 ℃冷鏈運輸箱，通過安檢并進行交接登記，由杭州經航空運送到達廣州白云機場，并及時遞交至微生物室，所有樣本存放總時間為7.0 h后接種。在空中時間約為2.5 h。

1.2.5培養和鑒定 接種：將接收到經不同貯存溫度、貯存時間和不同運輸工具處理后的樣本立即接種在生物安全柜內，吸取運輸培養基中全部(1.0 mL)樣本接種于血瓊脂平板，用接種環進行3區劃線，置于37 ℃ 微需氧，濕度95%環境中培養，3～6 d內觀察培養結果。

幽門螺桿菌的鑒定:(1)顯微鏡下幽門螺桿菌形態鑒定。吸取1滴無菌生理鹽水于潔凈載玻片上，用無菌接種環取單一菌落在鹽水中涂開，蓋上蓋玻片，普通顯微鏡下觀察。(2)涂片染色方法。吸取1滴無菌生理鹽水于潔凈載玻片上，用無菌接種環取單一菌落在生理鹽水中均勻涂開，自然干燥后按常規方法進行革蘭染色。(3)氧化酶試驗。準確加1滴試劑到空白紙片上(直徑6 mm)，將菌落涂在紙片上。10～30 s內出現紫色為陽性，無顏色改變或延遲反應為陰性。觸酶試驗：用無菌環或針，從平板上挑取單個菌落，置于載玻片上，滴加1滴觸酶檢測試劑。產生大量氣泡為陽性，沒有氣泡產生為陰性。尿素酶試驗：挑取大量培養18.0～24.0 h待試菌培養物接種于含液體培養基的試管中，搖均，于(36±1)℃培養10 min、1.0 h、2.0 h，分別觀察結果。如陰性繼續培養至4 d，作最終判定，變為粉紅色為陽性。梅里埃質譜儀VITEK MS鑒定:在VITEK MS-DS靶板點位制備成菌液檢測樣點，立即加1 μL VITEK MS-CHCA基質液,等待基質完全干燥并形成結晶后放入質譜儀檢測。

2 結 果

2.1培養和形態 固體培養到第3天時，幽門螺桿菌生長良好，哥倫比亞血瓊脂平板上見透明、針尖樣菌落形態；液體培養第3天時可見培養基明顯渾濁，涂抹少量菌液于無抗菌藥物的哥倫比亞血瓊脂平板培養，肉眼未見污染菌生長，并有透明、針尖樣的菌落長出；在無菌生理鹽水中：革蘭染色后細菌為革蘭陰性，固體培養基中的幽門螺桿菌為螺旋狀、海鷗狀、s狀彎曲菌或短桿菌；液體培養基中的幽門螺桿菌則多為螺旋短桿狀，亦見部分長絲狀細菌，有的互相纏繞聚集成團，有的散在分布，革蘭染色結果見圖1。

2.2鑒定結果 觸酶試驗陽性，氧化酶試驗陽性，尿素酶試驗陽性；梅里埃質譜儀VITEK MS 鑒定為幽門螺桿菌。

2.3貯存溫度和貯存時間對幽門螺桿菌生長的影響 樣本貯存溫度與存放時間對結果有非常顯著性影響。在24.0 h內相同貯存時間以貯存4 ℃時培養陽性率最高(40.4%±5.1%)，與其他各組比較差異有統計學意義(P<0.05)；在貯存6.0 h以內以貯存25 ℃時陽性率最高(71.2%±8.1%)，與35、-25、-80 ℃比較，差異有統計學意義(P<0.05)。不同貯存時間以-80 ℃結果最穩定，結果見表1。

注：與相同運輸時間貯存25 ℃結果比較，*P<0.05;與相同貯存溫度的0.0 h結果比較，#P<0.05

注：與相同運輸工具貯存6.0 h結果比較，*P<0.05； 與相同運輸時間對照結果比較，#P<0.05

2.4不同運輸條件對幽門螺桿菌生長的影響 樣本經過汽車、高鐵、飛機運輸后對幽門螺桿菌生長均有影響，以飛機運輸影響最明顯。樣本經過飛機運輸后幽門螺桿菌培養死亡率非常高，大多樣本無菌生長。運輸工具與貯存時間對幽門螺桿菌培養結果見表2。

3 討 論

幽門螺桿菌為革蘭染色陰性無芽胞、呈螺旋狀彎曲的桿菌，不僅寄生于胃腸道，而且在口腔及呼吸系統均分離到細菌，在人群中感染率達50%以上。據報道，幽門螺桿菌感染是消化系統慢性炎癥、胃部潰瘍、胃黏膜淋巴組織異常和淋巴瘤的主要致病菌和胃癌的一級致癌因子[3-9]。目前對幽門螺桿菌感染診斷方法種類眾多，不同方法檢出的陽性率差異明顯，有許多確定性方法如病理檢查、基因診斷等[10]。但如果進行致病機制、細菌分型、耐藥菌株、疫苗制備等研究，幽門螺桿菌培養法是“金標準”[11]。

國內外許多研究發現，幽門螺桿菌在遠離消化系統的其他器官中也能引起一系列的疾病，如幽門螺桿菌與維生素B缺乏[12]、特發性血小板減少性紫癜[13]、缺鐵性貧血[14]有關。同時發現幽門螺桿菌與神經[15]、頭頸部[16]、婦科疾病[17]、心血管[18]、糖尿病[19]和代謝綜合征[20-21]等相關。幽門螺桿菌細胞毒素相關蛋白A(CagA)是冠心病的危險因素，是ST段抬高型心肌梗死復發的預測因子[22]；幽門螺桿菌感染與阿爾茨海默病、癡呆、血管性疾病有關；還與頭頸部疾病、復發性阿弗他潰瘍、牙周炎、青光眼、中心性漿液性脈絡膜視網膜病變有關，可能是由于幽門螺桿菌定植于耳、鼻、咽喉所致。幽門螺桿菌在慢性阻塞性肺疾病中可能是致病因子。另外，感染CagA陽性的幽門螺桿菌可能導致男性不育，并與女性中妊娠期糖尿病有關[23]。

隨著臨床抗菌藥物的大量使用，幽門螺桿菌耐藥菌株的發生率日趨嚴重，但目前幽門螺桿菌的培養條件、藥敏試驗在我國仍難以常規開展，臨床根除性治療幽門螺桿菌多是按經驗用藥。由于幽門螺桿菌的體外培養不僅對培養基、儀器、操作技術等有特殊要求，對氣體環境更為敏感，幽門螺桿菌需在微需氧環境下生長，而大氣中和絕對厭氧的環境中不能生長，還需保持95%以上的相對濕度和37 ℃的溫度，且樣本離體后自然死亡率隨著存放時間和環境溫度改變對培養結果有非常顯著影響。本研究發現，幽門螺桿菌在24.0 h小時內相同貯存時間以4 ℃環境保存的樣本培養陽性率最高；貯存6.0 h以內以25 ℃陽性率最高，陽性率明顯高于貯存35、-25、-80 ℃環境。樣本長時間保存時以-80 ℃結果最穩定。本實驗結果表明，幽門螺桿菌樣本經過汽車、高鐵、飛機運輸對幽門螺桿菌生長均有影響，以飛機運輸影響最明顯。樣本經過飛機運輸后幽門螺桿菌培養成功率很低，大多樣本無菌生長，可能高空的外在氣壓改變使樣本處于低氧環境下對幽門螺桿菌生存存在干擾，本結果與郭春亮等[24]研究相符，他們在研究中發現，常規法、加氧法和加壓加氧法培養幽門螺桿菌的陽性率分別為1.1%、34.4%和31.7%，相同幽門螺桿菌菌株在相同的培養條件下，低氣壓的高原地區幽門螺桿菌生長緩慢且菌落數顯著低于平原地區，主要原因是低氣壓可致環境低氧，從而影響幽門螺桿菌的存活。

4 結 論

幽門螺桿菌樣本最佳存放溫度和接種時間：如能在6.0 h內接種，保存于25 ℃環境培養陽性率最高；24.0 h內接種，保存于4 ℃環境培養陽性率最高；長時間保存時以-80 ℃結果最穩定。飛機運輸時由于低氣壓可致樣本處于低氧環境，從而影響幽門螺桿菌的存活。因此，實驗室在進行幽門螺桿菌培養時，采集的樣本需要根據實驗情況選擇最合適的貯存時間、貯存溫度和運輸方式，以提高幽門螺桿菌培養的陽性率。