絲裂霉素C抑制FOXO1磷酸化調控結直腸癌細胞增殖和活力研究

龍道國，徐細明

(武漢大學人民醫院/湖北省人民醫院腫瘤科，湖北武漢 431900)

結直腸癌是許多國家發病率和病死率的主要原因，盡管近年來其發病率在世界發展中國家增加，但在較發達國家更嚴重[1]。目前，絲裂霉素C是最常用于加熱腹腔內化療的化學治療劑[2]，是一種具有抗腫瘤活性的天然抗菌藥物，已被用于多種實體腫瘤，包括乳腺癌、結直腸癌、非小細胞癌和膀胱癌[3]。WU等[4]研究發現，FOXO1的表達水平和磷酸化水平與結直腸癌細胞的增殖密切相關。SHEN等[5]研究發現，絲裂霉素C能調控腫瘤細胞中蛋白的磷酸化水平。本研究旨在探討絲裂霉素C、FOXO1磷酸化與結直腸癌細胞增殖和活力的關系。

1 材料與方法

1.1材料 絲裂霉素C購自北京百奧萊博科技有限公司(貨號：BP1618-KWB)。HA-Foxo1-WT和HA-Foxo1-MT的質粒購自北京中原公司(ADDGNE貨號：#10693、#9025)。HA、FOXO1A(phospho S256)、FOXO1A、TUBULIN抗體購自Abcam公司(貨號：ab18181、ab131339、ab39670、ab32124)。結直腸癌細胞HCT116購自上海子實生物科技有限公司(貨號：Qs101092)。RPMI培養基購自上海優予生物科技有限公司(貨號：lffs1847)，胎牛血清購自賽默飛世爾科技公司(貨號：10099-133)。蛋白酶抑制劑Cocktail (不含EDTA,mini片劑) 購自Bbimake公司(貨號：B14011)。PBS購自生工生物工程(上海)股份有限公司(貨號：E607008)。青鏈霉素混合液(100×)購自北京索萊寶科技有限公司(貨號：P1400)。2×十二烷基硫酸鈉(SDS)蛋白電泳上樣緩沖液購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司(貨號：WB-0081)。蛋白裂解液購自碧云天生物技術有限公司(貨號：P0013)。NanoFect轉染試劑購自南通柯侎克生物科技有限公司(貨號：NF100)。

1.2方法

1.2.1細胞培養、藥物處理和轉染 結直腸癌細胞HCT116維持在補充有2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素和10%熱滅胎牛血清的RPMI-1640培養基中，并在潮濕氣氛(37 ℃，5%CO2)中培養。絲裂霉素C以終濃度0.5 μg/mL處理結直腸癌細胞HCT116。通過NanoFect轉染HCT116細胞。將含HA-Foxo1-WT和HA-Foxo1-MT質粒分別與脂質體混合，靜止大約20 min后，緩緩滴入HCT116細胞。選用結直腸癌細胞系HCT116，PBS處理的HCT116為對照組，絲裂霉素C處理的HCT116為絲裂霉素C處理組，HA-Foxo1-WT轉染的HCT116為FOXO1-WT組，HA-Foxo1-MT轉染的HCT116為FOXO1-MT組，每組3例。

1.2.2免疫印跡 行10%或12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，然后轉移到PVDF膜。將PVDF膜在室溫下用5%脫脂奶粉的Tris緩沖液封閉1 h，然后在4 ℃下與HA、FOXO1A (phospho S256)、FOXO1A、TUBULIN抗體溫育過夜。然后將膜在室溫下與綴合有HRP的相應二抗孵育1 h。觀察特定蛋白質使用ECL Plus 免疫印跡檢測系統。

1.2.3MTT試驗 第1天使用胰蛋白酶消化HCT116細胞，將HCT116細胞稀釋至每毫升75 000個細胞,使用完全培養基稀釋細胞。根據MTT試劑盒的說明書進行操作。

1.2.4CCK-8試驗 在96孔板中分配100 μL HCT116細胞懸浮液(每孔5 000個細胞)。將板在潮濕的培養箱中預孵育24 h。根據CCK-8試劑盒的說明書進行操作。

2 結 果

2.1絲裂霉素C抑制HCT116細胞的增殖和活力 用絲裂霉素C處理細胞后，與對照相比，MTT試驗結果顯示，在第2天和第3天結直腸癌細胞HCT116的增殖受到明顯的抑制(t=8.023,P=0.016;t=6.814,P=0.021)；同時，CCK-8試驗結果顯示，第2天、第3天和第4天的細胞活力受到明顯的抑制(t=8.472,P=0.014;t=13.887，P=0.007；t=2.943,P=0.042)。見圖1、2。

注：與對照組比較，*P<0.05

圖1絲裂霉素C抑制HCT116細胞增殖

2.2絲裂霉素C抑制FOXO1磷酸化 用絲裂霉素C處理細胞后，與對照相比，免疫印跡試驗發現細胞中FOXO1的總量無明顯差異，但是S256位點的磷酸化FOXO1的蛋白量明顯減少(t=4.801，P=0.039)，見圖3。

注：與對照組比較，*P<0.05

圖2絲裂霉素C抑制HCT116細胞活力

圖3 絲裂霉素C抑制FOXO1磷酸化

圖4 FOXO1-WT和FOXO1-MT的表達

圖5 轉染FOXO1-WT和FOXO1-MT后HCT116細胞的增殖情況

注：2組比較，*P<0.05

圖6絲裂霉素C通過抑制FOBO1磷酸化抑制HCT116細胞的增殖

2.3絲裂霉素C通過抑制FOBO1磷酸化抑制HCT116細胞的增殖和活力 分別轉染HA-FOXO1-WT和HA-FOXO1-MT，HCT116細胞的增殖差異無統計學意義(t=0.079，P=0.77)。同時用絲裂霉素C處理，發現FOXO1-WT組的細胞增殖在第2天和第3天均明顯小于FOXO1-MT組(t=4.926,P=0.031;t=7.037，P=0.019)；FOXO1-WT組的HCT116的細胞活力在第3天和第4天均明顯小于FOXO1-MT組(t=14.089,P=0.005;t=13.741，P=0.008)。見圖4～7。

注：與FOXO1-WT組比較，*P<0.05

圖7絲裂霉素C通過抑制FOBO1磷酸化抑制HCT116細胞的活力

3 討 論

據報道，結直腸癌是全球第3大常見癌癥，2012年診斷出136萬人[6]。結直腸癌的預后與診斷有關，早期診斷時的5年生存率為90%，結直腸癌遠處轉移診斷時的生存率低于10%[7]。目前的治療藥物選擇包括絲裂霉素C、5-氟尿嘧啶、伊立替康、奧沙利鉑、替加氟-尿嘧啶/亞葉酸鈣和5-氟尿嘧啶前藥卡培他濱[8]。此外，最近將貝伐單抗、西妥昔單抗和帕尼單抗納入治療組合方案中[9]。然而，新的治療方案以增加毒性為代價改善了預后，并且患有轉移性疾病的患者最終將對可用藥物產生耐藥性，且其分子機制并未明確。因此，闡明分子機制和開發新的、有效的、毒性較小的藥物已成為當務之急。

FOXO1是FOX轉錄因子O亞家族的成員[10]。FOXO1與FOXO3、FOXO4等其他成員一起參與細胞周期退出和G1停滯，誘導細胞凋亡、氧化和細胞應答的細胞功能調節[11]。在本研究中，當細胞被絲裂霉素C處理后，發現磷酸化的FOXO1的表達被下調(P<0.05)。細胞中的FOXO1蛋白呈現磷酸化的無活性形式和未受磷酸化的活性形式[12]。因此，磷酸化的FOXO1的表達被下調，且未受磷酸化的FOXO1的活性形式被上調，HCT116的細胞增殖和活力明顯下降(P<0.05)。FOXO1-MT的突變體是在FOXO1磷酸化位點上進行的磷酸化模擬型突變，即FOXO1-MT持續磷酸化且無法被去磷酸化。分別轉染HA-FOXO1-WT和HA-FOXO1-MT，同時用絲裂霉素C處理，發現FOXO1-WT組的HCT116的細胞增殖和活力均明顯小于FOXO1-MT組(P<0.05)。本研究所用的FOXO1-MT的突變為T24A、S256A和S319A，提示絲裂霉素C調控的FOXO1磷酸化位點至少有T24、S256、S319中的一個。FOXO1的磷酸化酶和去磷酸化酶有PKB/AKT1、PKB/AKT2、SGK1、STK4/MST1、CDK1[13]，提示絲裂霉素C可能影響這些磷酸化酶的轉錄水平、蛋白水平或酶活性來抑制其功能。而僅分別轉染HA-FOXO1-WT和HA-FOXO1-MT，HCT116的細胞增殖差異無統計學意義(P>0.05)，提示在HCT116細胞中FOXO1處于高度磷酸化的無活性形式。而用絲裂霉素C處理后，野生型的FOXO1發生去磷酸化。因此，相比于持續磷酸化且無法被去磷酸化的FOXO1突變型，表達野生型的FOXO1的HCT116細胞的增殖和細胞活力明顯降低。隨著未磷酸化的FOXO1增加，蛋白質FOXO1易于進入細胞核[14]。因此，絲裂霉素C處理HCT116細胞后，入核的轉錄因子FOXO1對各種基因的轉錄調節活性，包括p27Kip1、p130-Rb2和細胞周期蛋白D1/2(細胞周期調節)，腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TRAIL)，進而抑制HCT116的增殖和細胞活力[15-17]。

綜上所述，絲裂霉素C通過抑制FOXO1磷酸化來降低結直腸癌細胞的增殖和活力。