間接免疫熒光法檢測抗核抗體對干燥綜合征診斷價值的meta分析

張敏杰，高玉芳，徐曉莉，羅文強

(咸陽市中心醫院醫學檢驗科，陜西咸陽 712000)

干燥綜合征(SS)是一種主要累及外分泌腺體的慢性系統性炎癥性自身免疫病，典型臨床表現為以外分泌腺淋巴細胞浸潤為特征的口眼干燥[1]。疾病進展期間，患者可出現各種系統性的臨床病變，如疲勞、關節炎、皮膚血管炎、血液病、肺間質疾病、腎衰竭、周圍神經和中樞神經病變、胃腸道疾病。因此，SS被認為是一種異常的自身免疫性疾病，具有廣泛器官特異性及系統性臨床癥狀，同時出現伴隨多種散在并發癥的血清學異常[1-2]。各種不同的臨床癥狀造成臨床對SS的診斷率較低。最新的臨床研究顯示疾病早期采用利妥昔單抗進行治療可提高唾液腺功能，減輕疲勞，減少腺體外器官受累癥狀[3-4]。這說明在對相關器官和組織造成不可逆的損傷之前，早期進行疾病鑒別診斷的重要性。自身抗體檢測已經成為診斷SS的標準之一，4種自身抗體抗-Ro/SSA抗體、抗-La/SSB抗體、抗核抗體(ANA)和類風濕因子(RF)在臨床上應用廣泛，其陽性率與SS不同臨床癥狀之間具有相關性。自身抗原Ro/La核糖核蛋白復合物抗體抗-Ro/SSA抗體、抗-La/SSB抗體是在SS患者中最常見的抗體。50%～70%的原發性SS患者可檢出抗-Ro/SSA抗體和抗-La/SSB抗體[5]。抗-Ro/SSA抗體可單獨檢出，也可與抗-La/SSB抗體同時檢出，但是，單獨抗-La/SSB抗體陽性較少見[6]。抗-Ro/SSA抗體和抗-La/SSB抗體陽性患者更年輕、病程更長、外分泌腺功能紊亂更嚴重且更易復發腮腺增大，同時可累及較小的唾液腺[7-8]。有研究顯示，抗-Ro/SSA抗體和抗-La/SSB抗體陽性SS患者腺體外器官受累癥狀更為普遍，主要包括脾腫大、淋巴結病、脈管炎和雷諾現象等[9]，且抗-Ro/SSA抗體和抗-La/SSB抗體會在疾病進展過程中持續存在[10]。研究表明，抗-Ro/SSA抗體和抗-La/SSB抗體對SS診斷特異度較高，但靈敏度較低，僅為25%～50%，對于腺體外臨床表現(如雷諾現象、皮膚脈管炎和腎臟受累等)明顯的陰性患者，需要進一步進行唇腺活檢以明確診斷，患者依從性差。且在SS患者中，使用不同的檢測方法抗-Ro/SSA抗體和抗-La/SSB抗體靈敏度和特異度差別較大。ANA抗原位點包括細胞核內核酸、組蛋白、非組蛋白、磷脂、各種蛋白酶及細胞質中各種細胞器，抗-Ro/SSA抗體靶抗原為細胞質小分子核糖核蛋白顆粒，抗-La/SSB抗體靶抗原為細胞核小分子核糖核蛋白顆粒，采用間接免疫熒光法檢測ANA，其熒光染色模型多為核顆粒型。59%～85%的原發性SS患者可采用間接免疫熒光法檢出ANA[11]，多見于女性SS患者，診斷平均年齡低于男性。原發性SS患者出現ANA陽性與病變范圍及受累器官多少存在相關性，同時高丙種球蛋白血癥患病率也更高[12]。由于SS引起的器官損害具有不可逆性，因此，SS診治的難點在于早期診斷，唇腺病例活檢為有創性檢查，損傷較大。早期唇腺病理改變具有非特異性，且診斷方法靈敏度低，限制了其在SS早期診斷中的作用。近年來ANA被廣泛應用于自身免疫性疾病及SS的診斷，結果不甚一致。本研究通過收集ANA用于SS診斷的研究數據，并進行meta分析，旨在明確ANA對診斷SS的特異度及靈敏度，綜合評價ANA對SS的診斷價值。

1 材料與方法

1.1文獻來源 計算機檢索中國期刊全文數據庫(CNKI)、萬方科技期刊全文數據庫、中國生物醫學文獻檢索數據庫(CBM)和維普中文科技期刊全文數據庫(VIP)中公開發表的采用間接免疫熒光法檢測SS患者血清中ANA的研究，檢索時限均從建庫至2018年10月。中文檢索詞為“干燥綜合征”“自身免疫性疾病”“結締組織病”“抗核抗體”或“自身抗體”。同時以“sj?gren′s syndrome (SS)”“anti-nuclear antibody (ANA)”“connective tissue disease(CTD)”“dryness symptoms”“autoimmune diseases (AID)”及相關同義詞聯合檢索PubMed、EMbase、Medline、The Cochrane Library外文數據庫。手工檢索其他相關文獻及納入研究的參考文獻，以補充獲取更多文獻，具體篩選過程見圖1。

1.2文獻納入與排除標準 納入標準，(1)研究類型：國內外已發表評價血清ANA檢測對SS診斷價值的研究。(2)研究對象：SS患者。診斷依據：根據唇腺組織病理檢查證實、美國歐洲共識小組(AECG)修訂SS診斷標準或美國風濕病學會(ACR)診斷標準進行診斷。除此之外，臨床診斷均可作為診斷依據。(3)方法：待評價試驗為以選擇Hep-2細胞作為抗原的間接免疫熒光法檢測ANA，結果判斷以抗體滴度≥1∶100為陽性。(4)結局指標：合并靈敏度、合并特異度、合并陽性似然比、合并陰性似然比、合并診斷優勢比、繪制匯總受試者工作特征(SROC)曲線并計算曲線下面積(AUC)。

排除標準：(1)采用非間接免疫熒光法檢測ANA的研究。(2)原始研究納入病例為SS合并其他自身免疫病的患者。(3)研究中納入病例≤20例的研究。(4)無法獲取四格表數據或者數據有明顯錯誤的研究。(5)同一研究者或者研究單位對同一人群進行的重復研究或重復發表、重復收錄的研究。

1.3文獻篩選、資料提取和質量評價 由2位研究者獨立篩選文獻并提取資料，對納入文獻進行偏倚風險評價，隨后進行結果對比，存在爭議的文獻由第3位研究者和第4位研究者協商決定。提取資料主要包括第一研究者、發表年份、時間范圍、研究對象所在國家、病例的診斷方法、納入對照的類型及病例與對照總數、性別、年齡。四格表數據真陽性(TP)、假陽性(FP)、假陰性(FN)、真陰性(TN)。采用質量評價工具(QUADAS-2)進行偏倚風險評價，QUADAS-2工具由4個部分組成，(1)病例的選擇；(2)待評價診斷試驗；(3)金標準；(4)病例流程和進展情況。由2位研究者獨立使用QUADAS-2工具對所有研究進行評價，結果所得一致性較好。其他信號問題的評判標準、偏倚風險和適用性判斷解釋見表1。

圖1 文獻篩選流程及結果

表1 QUADAS-2應用偏倚風險和適用性判斷解釋

1.4統計學處理 采用meta-Disc 1.4軟件進行meta分析，首先分析各研究間的閾值效應，計算靈敏度的對數與1-特異度的對數并行Spearman相關系數檢驗，P<0.05提示存在閾值效應。運用meta-Disc 1.4軟件進行異質性分析，計算診斷優勢比(DOR)的Cochran-Q值，I2值檢驗異質性。P>0.05，I2<50%則無統計學異質性，采用固定效應模型合并效應量。當P<0.05，I2>50%為存在統計學異質性，采用隨機效應模型合并效應量包括：合并靈敏度、合并特異度、合并陽性似然比、合并陰性似然比、合并診斷優勢比，擬合SROC曲線并計算AUC。采用meta回歸分析異質性來源，采用Stata12.0軟件繪制Deek′s漏斗圖非對稱檢驗評估是否存在發表偏倚，P<0.05為差異有統計學意義，表明存在發表偏倚。

2 結 果

2.1文獻檢索結果及納入研究的基本情況 2位研究者分別按照檢索策略檢索相關數據庫，初檢共獲得相關文獻436篇，通過閱讀相關參考文獻補充獲取文獻3篇。通過閱讀摘要排除重復文獻和不相關文獻，初步篩選后獲得文獻235篇。閱讀全文后根據排除標準分析文章內容和數據的完整性及正確性，排除相關文獻后，共計16項研究最終納入meta分析。納入研究的基本信息見表2。

表2 納入研究的基本特征

2.2納入研究的基本特征和偏倚風險評價 本研究共納入16項研究，包含SS患者851例，對照2 858例。對照類型包含非自身免疫性疾病患者、自身免疫性疾病患者、原發性膽汁性肝硬化患者、非結締組織病患者及健康者。病例選擇過程中有1項研究采用隨機法納入病例[15]，3項研究連續納入病例[14,20,28]。1項研究采用盲法檢測病例和對照ANA[28]，除5項研究外11項研究均明確說明ANA檢測以選擇Hep-2細胞作為抗原基質的間接免疫熒光法[17,19,22-23,26]。11項研究結果判斷以抗體滴度≥1∶100為陽性[13,15-16,19-23,26-28]；Hayashi研究最小稀釋滴度為1∶40，本研究錄入四格表數據是稀釋滴度為1∶160的結果，同樣Op de beeck的研究四格表數據也是稀釋滴度為1∶160的結果。有5項研究對ANA陽性結果進行熒光模型分析[15,18-20,25]。以AECG診斷標準或ACR標準為病例診斷標準的研究有11項，3項研究以1993年歐洲初始標準為診斷方法[13-15]，1項研究未對病例的診斷標準進行詳細闡述[19]，1項研究診斷標準為“自身免疫性疾病診斷標準”[25]。由于SS屬于慢性疾病，短期的時間間隔不會產生高風險偏倚，筆者設定時間范圍≤3年為恰當的時間間隔。所有原始研究均無失訪者或遺漏病例。采用QUADAS-2工具進行偏倚風險評價及適用性判斷，結果見圖2。

2.3meta分析結果

2.3.1ANA對SS的診斷價值評估 納入的16項研究包括SS病例851例，對照2 858例。Spearman相關系數為r=0.421(P=0.104)，提示定量評價無閾值效應，采用隨機效應模型進行meta分析，結果顯示：合并靈敏度為0.76(95%CI:0.73～0.79)，見圖3；合并特異度為0.90(95%CI:0.89～0.91)，見圖4；合并陽性似然比為9.54(95%CI:4.24～21.46)，合并陰性似然比為0.28(95%CI:0.13～0.61)；合并診斷優勢比為36.39(95%CI:14.16～93.47)；AUC為0.90，見圖5。

注：PS為病例的選擇；IT為待評價試驗；RS為金標準；FT為病例流程和診斷試驗與金標準之間的時間間隔

圖2納入研究的偏倚風險評價

2.3.2異質性檢驗 非閾值效應引起的異質性檢驗結果顯示，納入16項研究DOR對應的Cochran-Q=146.22 (P=0.000 0),I2=89.7%；meta分析納入的研究間均存在高度異質性。從臨床角度結合納入研究的特征按照以下因素進行meta回歸分析，尋找異質性來源：地區(分為“中國組”和“國外組”)；剔除2項滴度不詳研究，滴度(分為“≥1∶100”組和“<1∶100”)；剔除3項時間范圍不詳研究，時間范圍(分為>3年組和≤3年組)；對照類型分為“疾病患者”組和“健康者”組。結果發現“對照類型”是造成異質性的可能原因。剔除對照類型為疾病患者的6項研究后發現異質性得到改善[14,18,22,25,27-28]，DOR對應的Cochran-Q=28.15,I2=68.0%；剔除對照類型為疾病患者的研究后合并靈敏度降低為0.74(95%CI：0.70～0.78)，合并特異度為0.94(95%CI：0.93～0.95)，合并陽性似然比為13.10(95%CI：9.02～19.01)，合并陰性似然比為0.27(95%CI：0.09～0.81)，合并診斷優勢比為63.38(95%CI：29.42～136.53)，AUC為0.97。合并特異度、合并診斷優勢比、AUC均較高，異質性明顯降低。

圖3 ANA診斷SS合并靈敏度的meta分析

圖4 ANA診斷SS合并特異度的meta分析

圖5 ANA診斷SS的SROC曲線

2.3.3靈敏度分析和發表偏倚 將大樣本或者結果差異較大的研究剔除后再次進行meta分析，結果無變化，說明本研究穩定性好，結果可信。采用線性回歸的方法檢驗是否存在發表偏倚，繪制Deek′s漏斗圖，結果納入16項研究斜率系數的P值=0.381，無明顯發表偏倚，見圖6。

圖6 ANA診斷SS發表偏倚漏斗圖

3 討 論

SS是一種可以累及全身的自身免疫性疾病，因個體差異大，疾病診斷較困難。其診斷標準自1986年來經歷了多次的發展和演變。2002年由美國歐洲小組聯合修訂了之前的歐洲標準共同制定了“2002美國歐洲共識標準”，具有較高的診斷價值而取得了廣泛應用。2012年，由美國風濕病學會推薦了新的ACR標準，其中血清學指標中新添加的ANA≥1∶320并RF陽性仍具有較高的特異度。對于一些早期還未出現干燥性角結膜炎，唇腺活檢尚未發現陽性但血液中出現特異性抗體的SS患者，該條目能夠減少這類患者的漏診。目前，SOLOMON等[29]提出ANA對系統性紅斑狼瘡(SLE)和系統性硬化癥(SSc)診斷效果較好，對于SS診斷效果較一般。JEONG等[30]最新研究結果顯示，采用間接免疫熒光法法檢測ANA對于這3種疾病總體診斷效果相同(SLE靈敏度為95.2%，SSc靈敏度為93.6%，SS靈敏度為88.4%)。GONZALEZ等[31]的研究顯示，篩選酶免疫分析法(SEIA)檢測ANA對SLE的診斷靈敏度為61.8%，而間接免疫熒光法為76.5%，該研究采用1∶160作為臨界值可能是造成間接免疫熒光法診斷靈敏度較低的主要原因。LEUCHTEN等[32]研究顯示，采用間接免疫熒光法檢測ANA對SLE進行診斷，以1∶40為臨界值靈敏度為98.4% (95%CI:97.6%～99.0%)；以1:160為臨界值靈敏度為95.8%(95%CI:94.1%～97.1%)。本文通過對納入的16項研究進行meta分析，計算合并診斷效應量、擬合SROC曲線評價ANA對SS的診斷效能，通過分析研究間異質性來源，查找可能影響研究結果的因素，最后通過靈敏度分析和檢測發表偏倚評估本研究的可信度。結果顯示,16項研究采用間接免疫熒光法對SS患者及對照中ANA進行檢測，合并靈敏度為0.76，合并特異度為0.90，合并DOR為36.39，AUC為0.90。表明ANA對SS診斷價值較高。本文納入的16項研究間存在高度異質性(I2=89.7%)。經Spearman相關系數檢驗，異質性與閾值效應無關，進一步進行meta回歸，試圖尋找異質性的可能來源。結果顯示，地區、抗體滴度、時間范圍均不是異質性的來源，說明試驗設計的差異不會造成研究結果的明顯變化。然后，將“對照類型”作為協變量進行meta回歸分析，發現剔除對照類型中包含疾病患者的研究后合并靈敏度降低(0.74)、合并特異度(0.94)、合并DOR(63.38)、AUC(0.97)均較高，且異質性明顯降低(I2=68.0%)，表明對照類型的選擇可能是導致異質性的原因之一。為了判斷本研究的穩定性，以每次剔除1篇文獻的方法進行靈敏度分析。結果顯示，每次剔除1篇研究后，合并DOR均未發生明顯變化，提示本文受單個研究的影響較小，分析結果穩定可靠。本文納入的一些原始研究存在不足之處，大部分研究在病例選擇過程中未能進行隨機或連續納入，這就不可避免地存在潛在偏倚；除1項研究外其他研究均未采用盲法對ANA進行檢測；所有研究均為病例-對照研究，由于研究者事先明確診斷分組，ANA檢測試驗基本是在知曉臨床診斷的情況下開展的，因此會影響到試驗結果的判讀，很可能會夸大診斷的準確性。本研究還存在不足之處，盡管本研究廣泛地收集關于ANA診斷SS的相關文獻，但僅限于中、英文，尚未對中英文之外文獻數據庫進行檢索，因此,不可避免地存在出版偏倚和其他類型偏倚。SS診斷常有賴于臨床表現口干、眼干主觀性項目的評價及相關客觀檢查如唇腺活檢及自身抗體測定，由于SS診斷相對困難，本研究納入的文獻除部分文獻符合病理診斷標準外其余都是采用不同版本診斷標準診斷SS，甚至部分文獻未對診斷標準進行明確闡述。不同的診斷標準可能會對研究結果產生偏倚，因此更合理可靠的結果還需要更多高質量的研究來補充和完善。

4 結 論

本研究通過診斷性meta分析旨在評價血清ANA檢測對SS的診斷價值，為SS的診斷提供循證醫學的依據。結果表明，間接免疫熒光法檢測ANA作為血清學指標診斷SS具有較高的特異度和靈敏度，對SS臨床診斷價值較高，可以作為SS早期診斷的血清學篩選指標。