循環腫瘤細胞檢測在肺癌中的應用

毛 莉，李金密，任曉東，陳 敏 綜述，黃 慶 審校

(陸軍軍醫大學大坪醫院/野戰外科研究所檢驗科，重慶 400042)

肺癌在全世界的發病率和病死率居高不下，近年來更是一躍成為中國最常見的死亡原因[1]。由于缺乏理想的早期診斷方法，且肺癌患者在發病早期的臨床癥狀不明顯，導致肺癌確診時已發病至中晚期，使患者錯過了最佳的治療時期。因此，肺癌的早期診斷是降低肺癌患者病死率的關鍵。近年來，隨著循環腫瘤細胞(CTCs)檢測技術的發展，特別是CellSearch系統在臨床實踐中的廣泛應用，CTCs檢測將成為對腫瘤早期診斷、治療及預后評估的新型工具。本文綜述近年來CTCs檢測診斷技術的進展及其在肺癌診斷中的應用，并對其檢測技術面臨的挑戰進行探討。

1 CTCs檢測技術的進展

1869年，ASHWORTH[2]在腫瘤患者的血液中檢測到CTCs，并且發現在腫瘤發生早期即有CTCs通過血液循環發生全身擴散的現象，這一發現開啟了國內外多個國家醫學專家的研究熱潮。CTCs進入血液循環后通過遷移、黏附、相互聚集形成微小癌栓,并在一定條件下發展為轉移灶，CTCs在腫瘤的發生發展和轉移擴散中均扮演著重要角色[3]。

1.1CTCs的富集 CTCs在外周血中的濃度極低,出現的概率約為每109個血細胞中出現1個CTCs[4],所以，CTCs檢測的關鍵在于能否在復雜環境中準確、高速有效地富集CTCs。根據檢測原理，CTCs的富集方法可分為特異性富集方法和非特異性富集方法。特異性富集方法基于CTCs細胞表面的標志物如細胞角蛋白(CK)等進行富集，包括免疫磁性分離法(IMS)、芯片富集法、納米粒富集法等。其中 IMS是目前用于富集CTCs最常見的方法，它的原理是在外部磁場中，相應的抗原抗體復合物附著在磁珠上并保留在磁場中,而沒有這種表面抗原的其他細胞由于不能與連接著磁珠的特異性單克隆抗體結合而不具有磁性,不在磁場中停留,從而使腫瘤細胞得以分離[5-6]。非特異性富集方法是根據CTCs自身的物理特性，如大小、密度等進行富集，包括密度梯度離心法、細胞大小富集法等。密度梯度離心法是目前實驗室常用的一種基于形態學特點富集腫瘤細胞的方法,該方法設備要求低，操作簡便，但該方法血液需求量大，靈敏度低，重復性較差。

1.2CTCs的檢測 根據檢測原理，富集CTCs檢測方法可分2大類:細胞計數法和核酸檢測法。前者主要包括各種免疫細胞化學技術(ICC)、流式細胞術(FCM)等，后者主要包括PCR、逆轉錄PCR等技術。

1.2.1ICC ICC指以顯色劑標記的特異性抗體與CTCs特異性結合后，通過顯色劑顯色反應對相應抗原進行定位、定性和定量測定的技術。ICC檢測能夠對細胞大小和形態進行分析，但靈敏度低，只能從(1～10)×105個正常細胞中發現1個腫瘤細胞[7]，這無疑限制了其在臨床上的應用。

1.2.2FCM 該方法集激光、電子物理、光電測量、計算機、細胞熒光化學及單克隆抗體技術為一體，能夠對細胞和亞細胞結構進行檢測的方法。近年來有一種微創體內檢測技術，通過將熒光標記的單克隆抗體注射入體內，通過放置于血管的激光檢測流過的CTCs,極大地彌補了檢測靈敏度的不足。

1.2.3PCR 該方法主要通過檢測癌基因、抑癌基因的突變或染色體質量產生的異常DNA來檢測腫瘤患者外周血中的CTCs。

1.2.4逆轉錄PCR 該方法是在PCR的基礎上擴增由腫瘤特異性mRNA序列逆轉錄的DNA片段,由于這些特異性的mRNA通常不表達于正常外周血細胞，因此，在某些基因改變后，可以基于組織或腫瘤特異性mRNA的表達或某些基因改變后RNA水平的異常可以間接檢測到CTCs的存在[8]。此法靈敏度較高，但是假陽性率高，無法檢測CTCs細胞形態等問題局限了該方法在臨床上的應用。隨著近幾年逆轉錄PCR技術的發展，實時定量逆轉錄PCR、熒光定量逆轉錄PCR等新方法的出現，由于其高擴增效率和高特異度、靈敏度，逆轉錄PCR及其改進技術廣泛應用于CTCs的檢測中，被公認為目前最準確的檢測方法[9]。

1.2.5富集與檢測技術結合 為了加速CTCs檢測在臨床實踐中的應用，近年來，結合富集和檢測技術的自動化檢測系統已被用于提高檢測的靈敏度和特異度。目前，CellSearch檢測系統相對成熟并得到廣泛應用。CellSearch 系統是一個使用靈活，功能強大的研究平臺。

CellSearch檢測系統首先通過納米磁珠特異性地富集血液中的CTCs。再進一步將富集出來的CTCs進行化學或生物染色，最后通過檢測系統完成對CTCs的準確檢測。該系統具有特異度、靈敏度、重復性高的優點，可從400多億的血細胞中檢測到單一的一個CTCs,并且檢測結果準確可靠。值得注意的是，使用單一抗原富集CTCs(如表面的EpCAM)經常導致檢測結果中的假陰性，因為并非每種腫瘤細胞都表達上皮標志。為了避免這一問題的出現，研究者開始加入新的表面分子。使用抗EpCAM和抗CK(CK7/8)的免疫磁珠富集CTCs，用酶學方法去檢測CTCs[10]。OncoCEE平臺運用了多種混合抗體富集轉移性乳腺癌患者的CTCs，與CellSearch相比，靈敏度提高了21%[11]。雖然使用新的檢測標志物可以提高檢出率，但同時會增加與正常有核細胞的特異和非特異性反應，因此，只有篩選出具有強特異度的標志物才可以提高CTCs的檢出率。此外,具有高靈敏度的CTCs-Chip也是一項集富集與檢測為一體的先進技術,即使只有極少量的腫瘤細胞,CTCs-Chip技術也可以一步將它們于全血中捕獲,捕獲的腫瘤細胞存活率高達98%[12]，并且檢測結果不受腫瘤細胞間歇性釋放的影響。鑒于肺癌影像學篩查的效用和成本爭議，CTCs-Chip的血液檢測作為吸煙者等肺癌高危人群的篩查工具極具吸引力。

2 CTCs在肺癌中的應用

肺癌是當今世界各國常見的惡性腫瘤，肺癌患者的5年生存率低于15%[13-14]，其中非小細胞肺癌占肺癌患者總數的80%～85%[15]。近年來，基于血液中生物標志物的液體活檢技術為肺癌的早期診斷與早期轉移復發的檢測提供了新思路，這些生物標志物包括循環腫瘤DNA(ctDNA)[16]和CTCs。ctDNA主要是指來自腫瘤細胞壞死凋亡后釋放于人體血液系統中不斷循環的腫瘤基因組游離DNA片段[17]。CHAN等[18]通過對比肺癌患者與健康人的ctDNA含量的顯著差異，證明通過檢測ctDNA含量的變化，可以對肺癌高危人群進行早期篩查。相較于ctDNA檢測，CTCs檢測具有獨特優勢，通過檢測從實體腫瘤上脫落后進入血液循環的腫瘤細胞，對轉移癌的診斷具有極高的特異度，能夠鑒定所有類型的腫瘤細胞，并且能進一步進行腫瘤分子生物學和遺傳學分析。

研究發現，進入人體循環系統的CTCs絕大多數被機體的免疫系統殺傷或在血液動力學的作用下破壞死亡，只有少數能存活下來,并在一定條件下發展為轉移灶[19]，而外周血中CTCs的數量反映了肺癌發生血行轉移的程度和能力，CTCs計數會隨著腫瘤遠處轉移的進展而顯著增高。此外，CTCs在肺癌的早期診斷、微轉移、評估療效與預后、選擇合適的個體化治療等方面的作用也得到了大量的研究證實。LV等[20]使用CellSearch系統檢測32例非小細胞肺癌患者肺靜脈血中的CTCs，結果顯示陽性率為90.6%(29/32)，且CTCs計數與腫瘤大小呈正相關(P=0.012),后將來自3例患者的富集的CTCs注射到3只免疫缺陷小的小鼠中，1只小鼠產生異種移植腫瘤，表明CTCs檢測有助于早期發現肺癌及可能出現的微轉移。LOU等[21]使用定量PCR和免疫細胞化學法檢測各階段肺癌患者的外周血CTCs,結果顯示陽性率為70%，研究結果同時表明，CTCs陽性率與血清腫瘤標志物(包括血清癌胚抗原、細胞角蛋白片段19抗原21-1)升高的水平無關，但與肺癌的臨床分期有關，其中Ⅰ期肺癌的陽性率為67.2%，CTCs對肺癌的早期診斷更為靈敏。FIORELLI等[22]應用細胞大小富集法從77例患有惡性(n=60)和良性(n=17)肺病變的患者外周血中分析CTCs,統計數據表明，60例(90%)惡性腫瘤患者中有54例檢測出CTCs，17例(5%)良性患者中有1例檢測出CTCs，在測試的Ⅰ期肺癌患者(42%)中，CTCs的數量與腫瘤大小相關(P=0.001)。另一項研究數據表明，CTCs在肺癌早期即可檢測到，陽性率為68%[23]，表明CTCs檢測有助于早期發現肺癌及可能出現的微轉移。PUNNOOSE等[24]通過CellSearch法檢測41例非小細胞肺癌患者的CTCs,發現CTCs計數的降低與放射性治療具有相關性，表明CTCs檢測可作為肺癌患者放射性治療后的檢測手段。MAHESWARAN等[25]采用CTCs-Chip法檢測27例非小細胞肺癌患者的CTCs,結果顯示，從接受酪氨酸激酶抑制劑治療的EGFR突變患者中收集的CTCs中檢測到T790M突變(該突變賦予藥物抗性)，表明CTCs檢測可作為肺癌患者靶向藥物治療后檢測治療期間基因型變化的方法。BREITENBUECHER等[26]研究表明，攜帶EGFR突變的肺癌患者中有84%的CTCs可檢測到EGFR突變，在94%的病例中，CTCs中發現的突變與腫瘤組織中的突變不一致，這可能是由于原發病灶和轉移部位之間的腫瘤異質性導致。 TANIGUCHI等[27]采用逆轉錄PCR法檢測8例肺癌患者的CTCs，結果顯示EGFR突變患者在CTCs中均表現出相同的突變。 此外，CTCs在其他腫瘤的臨床應用方面也取得了一些進展，如胰腺癌、胃癌、膀胱癌。

3 CTCs檢測面臨的挑戰與展望

CTCs檢測是一種真正的無創、可以動態監測病情變化、對于腫瘤的早期診斷、復發與轉移、靶向藥物篩選等具有重要臨床意義的檢測方法，在惡性腫瘤精準醫療領域具有良好的臨床應用前景和巨大的社會效益。但目前尚缺乏規范的檢測流程與相應的質量標準，還需進一步的臨床試驗去完善檢測的重復性。各種富集和檢測新方法的聯合使用也將極大地提高檢測的靈敏度和特異度，隨著技術的不斷改進與發展,CTCs檢測必將在臨床腫瘤診治中得到推廣應用。