Sanger測序法在乙型肝炎患者耐藥突變檢測中的應用?

馬 亮，于 洋，張婧瑩，叢 笑，劉 倩，楊 輝，曹永彤

(中日友好醫院檢驗科，北京 100029)

乙型肝炎病毒(HBV)是一種經血液傳播的嗜肝DNA病毒，是導致慢性肝炎、肝癌和肝硬化的重要因素。慢性乙型肝炎病毒(CHB)在我國是一種傳播范圍廣、感染人數眾多的傳染性疾病，我國HBV慢性感染者約為9 000萬，居世界之首，每年約100萬人死于HBV感染所致的肝硬化、肝衰竭及原發性肝癌[1-2]，CHB的監控和治療一直以來都是傳染病防治的重中之重。目前核苷酸類似物治療CHB患者的療效已得到肯定，但因其對HBV cccDNA無直接作用，患者需長期服用，在治療過程中很容易引起HBV耐藥突變[2]。長期使用單種核苷酸類藥物，患者很容易發生針對此藥物的耐藥突變。同時，由于單種核苷酸藥物耐藥突變位點所對應藥物的多重性，患者很可能產生新的耐藥或交叉耐藥，為臨床治療帶來困難[3]。使用體外檢測手段，對CHB患者進行基因耐藥突變檢測，可以準確有效地對其突變位點進行檢測，以判斷該患者對已知藥物的耐受程度，進而更好地指導臨床用藥，制定個體化抗病毒治療方案。目前，已有多種分子診斷技術平臺可以檢測乙型肝炎耐藥基因突變[4]，Sanger測序法作為測序檢測的“金標準”，是目前最為準確、有效的檢測手段。本實驗使用Sanger測序法對CHB患者血清核酸PCR產物進行測序，檢測HBV耐藥相關位點突變及HBV病毒基因型，統計目前常用藥物對應位點發生突變的情況，為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1病例標本 收集2016年10月至2018年6月中日友好醫院CHB患者血清共215例，其中男42例，女73例，年齡19～84歲，中位年齡39歲。所有患者均符合乙型肝炎診斷標準(WS299-2008)，HBV-DNA 大于1×103U/mL，患者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑和儀器 HBV-DNA提取試劑盒，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；HBV-DNA純化試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；HBV-DNA測序試劑盒購自廣州立菲達安診斷產品技術有限公司；C-1000 TOUCH PCR儀購自美國BioRad公司；3500Dx測序儀購自美國ABI公司。

1.3方法

1.3.1標本采集 采集患者空腹不抗凝靜脈血5 mL,2 500 r/min離心10 min,分離血清。

1.3.2HBV-DNA提取 使用生工生物工程(上海)股份有限公司DNA提取試劑盒，按照試劑說明書提取HBV-DNA。

1.3.3HBV-DNA擴增 50 ℃ 2 min，95 ℃共15 min預變性，94 ℃ 30 s→55 ℃ 30 s→72 ℃ 45 s，40個循環，72 ℃ 7 min。

1.3.4HBV-DNA純化 使用生工生物工程(上海)股份有限公司提取試劑盒，按照說明書所列步驟進行純化。

1.3.5測序PCR 體系配置 PCR產物 0.5 μL，BigDye 2 μL，BigDye Buffer 3 μL，測序引物1 μL，無菌純化水13.5 μL，總體積20 μL。擴增程度為96 ℃ 1 min，然后96 ℃ 10 s→50 ℃ 5 s→60 ℃ 4 min共25個循環，最后4 ℃保溫。

1.3.6測序產物純化 各PCR反應管加入2 μL 125 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)和2 μL 3 mol/L醋酸鈉(pH 5.2)，再加入50 μL 100%無水乙醇，短時振蕩，室溫避光放置15 min；4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，去上清，加入150 μL預冷70%乙醇，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，去上清，室溫避光放置15～30 min；加入10 μL Hi-Di Formamide，短時振蕩溶解DNA，短時離心，95 ℃變性5 min，冰中冷卻4 min。

1.3.7電泳 使用1%瓊脂糖電泳，觀察PCR產物存在及純化情況。

1.3.8測序 變性后的測序產物加入與基因分析儀配套的96孔板，選用具有IVD標志的Seq_std_BDTV3.1_ASSY_POP7 進行測序。

1.4數據收集與分析 使用ABI公司Data Collection?與Sequencing Analysis軟件進行數據收集和初步分析，使用STANDFORD軟件對數據進行深度分析。

1.5統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件對數據進行處理。計數資料組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1在本研究215例患者中，共有40例(18.6%，40/215)患者檢測到發生耐藥基因突變，其中具有對應參考價值的為21例(9.77%，21/215)。該215例患者中相關藥物耐藥突變率從高至低依次是拉米夫定(LAM,9.77%,21/215)、恩曲他濱(FTC,7.44%,16/215)，恩替卡韋(ETV,6.98%,15/215)，替比夫定(LdT,6.05%,13/215)，阿德福韋(ADV,0.93%,2/215)；未檢出與替諾福韋(TDF)耐藥相關突變。常見CHB治療用藥與相關耐藥突變位點，TDF為A194T；LdT為M204I；ADV為A181V/T、N236T；LAM/LMV為M204I/V、A181T/V、L180M、V173L；FTC為M204I、L180M、V173L；ETV為M204I、L180M。見表1。其余19例雖然檢測到突變位點，但所發生突變的位點并不與耐藥明確相關，以備注中與耐藥明確相關的6個位點作為參考標準。

2.2耐藥連鎖位點突變情況 在檢測到的21例耐藥突變患者中，發生耐藥連鎖位點突變的共11例，占52.38%(11/21)，其余為47.62%為單一位點突變。最主要的連鎖模式為M204I+L180M，共7例；剩下兩種連鎖模式A181V+N236T和M204V+L180M各2例。

2.3不同基因型耐藥基因發生情況 本研究215例患者中B基因型占所有患者的29.77%(64/215),耐藥發生比例為6.25%(4/64)；C基因型占所有患者的68.84%(148/215),耐藥發生比例為11.49%(17/148)；D基因型占所有患者的1.40%(3/215)，耐藥發生比例為0。本研究中C基因型明顯高于B基因型(P<0.01),C基因型與B基因型基因突變情況差異無統計學意義(P>0.05)。

注：-表示無數據

3 討 論

乙型肝炎治療的總體目標是最大限度地長期抑制或消除HBV,減輕肝細胞壞死及肝纖維化，延緩或阻止疾病進展，減少或防止肝硬化，肝癌及其并發癥的發生。核苷類藥物抗病毒治療能很好控制疾病進展，長期治療能使患者肝組織得到改善[5]。但是，長期應用核苷類藥物會使HBV在藥物選擇壓力和免疫壓力下發生突變，產生耐藥基因甚至臨床耐藥突變[6]。耐藥的發生極大地降低了CHB患者的治療效果。因此在治療過程中動態地進行耐藥監測對CHB的治療和預后具有重要的意義。

而LAM目前仍是我國臨床進行抗HBV治療的主要藥物，本研究中215例患者中21例患者發生LAM耐藥突變，突變比例為9.77%(21/215)。在21例患者中，18例檢測到M204I/V位點突變，其中9例伴隨L180M位點突變；1例為V173L位點突變；2例為A181V突變。這類突變發生的比例較高，提示了LAM易產生耐藥性。本研究結果與王清等[7]研究結果較一致。本研究中其他耐藥突變檢出率從高到低依次為FTC(16/215,7.44%)，ETV(15/215,6.98%)，LdT(13/215,6.05%)，ADV(2/215,0.93%)；未檢出與TDF耐藥相關突變。所以從本研究結果可以看出FTC、ETV和LdT 3種藥物耐藥發生率也比較高。患者發生TDF耐藥突變在臨床上確實很少出現，這也指示了TDF在乙型肝炎治療廣闊的應用前景。

HBV耐藥突變位點連鎖分析是指研究多個耐藥突變位點是發生于同一個病毒株上還是位于不同病毒株上以及耐藥位點的組合方式。多數情況下對同一藥物的耐藥是由多個耐藥突變位點的存在所造成，并且多個耐藥突變位點的組合情況對抗病毒藥物是否產生耐藥以及耐藥的程度存在很大的不同[8]。LAM主要的耐藥突變位點M204V/I較野生復制能力低，而L180M、V173L的出現使突變株HBV的復制能力接近野生株的水平[9]，因此，對HBV耐藥突變位點進行連鎖分析對于臨床抗病毒治療方案的選擇以及流行病學的研究意義重大。本研究中主要的連鎖模式也是M204I+L180M，與既往研究結果類似[10-11]。

HBV病毒可分為A～I 19種基因型，HBV基因型具有一定的地域性差異，我國南方以B型為主，北方以C型為主，D型主要見于西藏和部分少數民族地區。本研究中C基因型明顯高于B基因型(P<0.01),支持HBV基因型具有地域性差異這一結論。并且本研究中也檢測到少量D基因型1.40%(3/215)，這可能與北京人口流動較大有關。

關于HBV基因型與核苷類耐藥的相關性分析，結論各有差異，有研究認為二者具有相關性[12]；另一項薈萃分析則表明二者之間沒有顯著相關性[13]。本研究中C基因型耐藥基因發生頻率高于B基因型，但差異無統計學意義。

4 結 論

本研究采用一代測序方法對乙型肝炎耐藥基因突變進行了初步分析，可以看到乙型肝炎耐藥在乙型肝炎患者人群中發生的情況，對乙型肝炎患者臨床用藥具有一定指導作用，也提示了臨床進行乙型肝炎耐藥檢測的必要性。