原發性膽汁性膽管炎中表觀遺傳誘導的分泌障礙

徐剛 陸倫根

原發性膽汁性膽管炎(PBC)是一種慢性緩慢進展的肝臟疾病，與自身免疫異常有關，通過選擇性破壞中小膽管，導致肝內膽汁淤積和肝損傷。PBC最常見于中年婦女，男/女比例約1∶1.6～10。

PBC的發病機制目前仍不明確。在過去數十年里，學者認為，環境因素與PBC的免疫耐受缺失及病理發病機制有關。微生物、真菌及病毒的感染，微生物群，污染及輻射等因素被認為是可能的疾病誘發因素。目前認為PBC受多因素、多基因影響，不僅環境因素會導致免疫耐受破壞，遺傳易感性及表觀遺傳同樣在PBC的發病機制中起重要作用。

一、遺傳易感性

雙胞胎的研究發現，單卵雙生嬰兒中將來PBC的發病率較異卵雙生高，高度提示有明顯的遺傳易感性，但單卵雙生也存在不一致，單卵雙生子中，患病者和非患病者的基因表達譜出現差異，包括拷貝數變異和DNA甲基化模式的改變。此外，罹患PBC的女性患者中頻繁出現X染色體單體，尤其是在B細胞和T細胞，這部分解釋了為何女性易罹患PBC。X染色體的丟失有傾向性，通常多見于一側親代來源的染色體。因此，在PBC患者中需要進一步的遺傳資料分析和X染色體相關的研究以證實并進一步深化對這些遺傳改變的理解。

(一)染色體結構的改變 端粒是位于染色體末端的重復DNA結構，和特定蛋白結合。端粒重復結構的丟失導致細胞衰老。研究發現[1]，在慢性病毒性肝炎和PBC時被破壞的小膽管和毛細膽管的膽管內皮細胞(BECs)中，端粒較PBC未被破壞的膽管和毛細膽管的BECs明顯變短。端粒失調引起DNA破壞，提示端粒的縮短導致膽管細胞的衰老，可能參與了PBC膽管破壞過程。

(二)PDC-E2免疫耐受性的破壞 PBC與PDC-E2免疫耐受的缺失密切相關。在培養的人BECs細胞的凋亡小泡膜表面發現原生及抗原激活的PDC-E2，形成細胞頂體(apotope)，從而激活免疫系統，BECs凋亡和對凋亡細胞吞噬作用的變化可以很好的解釋了PBC的組織特異性和對線粒體抗原耐受性的破壞。很多觀點均支持化學復合物和(或)感染因子極有可能通過分子相似和交叉反應機制與耐受破壞有關。

(三)陰離子交換體2AE2和PBC：分泌障礙的關系 早在20世紀90年代早期，Prieto等提出，PBC患者存在膽道碳酸氫鹽分泌異常，并與膽汁淤積有關。兩種膽汁酸相關治療可改善膽汁淤積相關的生化和組織學改善，生存期延長[2]。PBC患者肝活檢組織和外周血單核細胞中AE2的表達較正常對照明顯降低。此外，在PBC患者體內分離培養的膽管細胞中，AE2的活性也較正常人膽管細胞降低。這些資料均提示，PBC患者存在膽道碳酸氫鹽分泌過程的損害，導致膽汁淤積。此外，膽管細胞內pH(pHi)的改變可引起嚴重的細胞功能紊亂和膽管細胞損傷。Ae2a-/b-小鼠可發生自發的嚴重肝膽損傷和與PBC相似的免疫學表現，包括門靜脈內CD4+和CD8+T淋巴細胞的浸潤，膽管損傷，膽管細胞氧化應激增加，膽管周圍肝纖維化，干擾素γ和IL-12合成增加，血清IgM、IgG和肝ALP水平升高以及血清PDC-E2特異性AMA抗體陽性。PBC免疫細胞中的AE2缺陷也可能在自體免疫現象中起重要作用。ae2缺陷小鼠的CD8+T細胞中，pHi堿性化，細胞增殖和激活增加，程序性細胞死亡蛋白-1表達被抑制，同時伴有細胞凋亡減少，有助于免疫介導的慢性膽管炎的發生。PBC時AE2表達和活性的減少，首先損害膽道碳酸氫鹽分泌，導致膽汁淤積和膽管細胞損傷，隨后破壞易感膽管細胞的免疫耐受并誘發對膽管細胞的自體免疫，進一步加重膽道損傷和膽管開放。值得注意的是，至今仍未發現在AE2基因座的SNPs，強烈支持PBC時AE2的改變主要通過表觀遺傳修飾所致。

二、表觀遺傳和PBC

動態環境變化可能主要通過表觀遺傳修飾而與患者的表型密切相關。因此，所有周圍環境的動態變化均可強烈改變表觀基因組，改變基因的表達。對表觀遺傳過程包括DNA甲基化譜、組蛋白變體、非編碼RNAs、翻譯后修飾等。

(一)DNA甲基化 芯片技術發現，在非同卵雙生子的PBC患者PBMCs中，編碼調節鈣體內穩態的細胞內Cl-通道CLIC2 和促進有絲分裂調節細胞增殖的肽基脯氨酰順/反式異構酶的細小病毒家族成員PIN4 mRNA的表達明顯下調。一項全基因組研究也證實，在PBC患者的PBMCs中，60個不同基因區域同時存在甲基化譜的變化。值得注意的是，所有這些基因區域在同時罹患疾病的雙生子中均存在超甲基化，而未罹患疾病的雙生子則沒有超甲基化，其中51個基因特異性定位于X染色體，僅9個基因在常染色體有表達。尤其是其中一些超甲基化的基因編碼與膽鹽及離子運輸相關蛋白。

(二)組蛋白變體和翻譯后修飾 組蛋白通過翻譯后修飾以調節某些特定基因的轉錄機制。在PBC患者的T淋巴細胞中，逮捕素-1的過度表達促進T細胞增殖，并改變與自體免疫有關的多種基因的表達，增加了在PBC患者中的CD40L、LIGHT、IL-17和IFNGH4基因啟動子區域的組蛋白的乙?；鳷RAIL、APO2和HDAC7A的啟動子區域H4組蛋白乙酰化降低。

(三)微小RNAs 微小RNAs(miRNAs)是人類表觀遺傳因素中研究最多的一種。miRNA表達譜的異常和包括肝臟疾病、膽管疾病、自身免疫綜合征等很多的人類疾病有關，許多種miRNA均有差異表達。其中，對PBC患者肝臟和血PBMCs的微陣列分析發現，有超過200種miRNAs的差異表達。其中miR-506是PBC時膽管細胞病理生理學改變的主要參與者之一。

研究發現，PBC患者有35種miRNAs的失調，其中miR-506可能是AE2表達的直接調節者，在PBC患者肝臟內表達上調，并與人特異性AE2-UTR-3’mRNA序列部分互補，定量PCR也證實，PBC患者肝臟內miR-506上調。原位雜交技術則發現，miR-506在肝內膽管細胞中特異性表達，直接和AE2mRNA的結合位點結合，蛋白翻譯減少，非Na+依賴性Cl-/HCO3-交換活性降低，促胰液素誘導的頂側膜氫離子通量減少，高度提示miR-506/AE2軸在調節體內pH穩定和PBC時的膽道碳酸氫鹽分泌系統中起關鍵作用。

在人膽管細胞中誘發miR-506過度表達后，與對照組細胞相比，改變了很多與線粒體能量代謝有關的蛋白，導致線粒體基礎呼吸、最大呼吸、ATP相關呼吸和非線粒體呼吸的增加，同時伴有細胞外酸化速率、糖酵解和氧化磷酸化過程的加快，質子漏和線粒體解偶聯也和miR-506的過度表達有關，最終因為線粒體活性的損傷而導致ATP水平降低。此外，miR-506的過度表達也抑制了膽管細胞的黏附和遷移，增加細胞應激反應，使膽管細胞對毒性膽汁酸凋亡作用的敏感性增加。值得注意的是，miR-506過度表達的膽管細胞也有PDC-E2蛋白的強烈的異常的過度表達，其表達主要位于細胞質和質膜，提示miR-506、AMAs和自身免疫現象可能存在一定關系。

除了AE2, 和PBC病理發生機制密切相關的另一miR-506的直接靶點是調節膽管細胞內質網質膜Ca2+釋放通道的肌醇1，4，5-三磷酸受體3(InsP3R3，也稱為ITPR3)。在PBC，膽管細胞表達InsP3R3減少，細胞內Ca2+信號通路和膽道碳酸氫鹽分泌受損，激活膽汁淤積。InsP3R3 mRNA含有2個高度保守的miR-506結合位點，調節其表達。因此在miR-506過度表達的膽管細胞中，InsP3R3 mRNA水平和蛋白水平均降低，導致內質網釋放Ca2+明顯減少，膽道分泌障礙。

(四)長非編碼RNAs 長非編碼RNAs(lncRNAs)是高度保守的RNA序列，含>200核苷酸，表觀遺傳性調控基因表達和很多細胞功能。在PBC患者，有38個SNPs定位在lncRNAs。此外，lncRNA AK053349在CD8+T細胞中有高表達，并和T淋巴細胞的激活及自體免疫有關。PBC患者體內的PBMCs中的LncRNA AK053349的表達增加并與Mayo風險評分呈正相關，強調其在PBC病理發生過程中的重要作用，并期待進一步的研究。

(五)環狀RNA 環狀RNA是一種新發現的普遍存在的內源性非編碼RNA(ncRNA)，作為哺乳動物的基因調節者發揮作用。研究發現[3]，PBC患者血清中，有18種環狀RNA(circRNA)上調，4種下調，其中hsa_circ_402458、hsa_circ_087631、hsa_circ_406329上調最為明顯，而hsa_circ_407176、hsa_circ_082319則明顯下調 ，hsa_circ_ 402548在UDCA治療后的PBC患者血清中明顯下降。提示circRNA可能也參與PBC的病理發生機制，并可能是PBC的一個潛在生物標志物。

PBC的病理發生機制比之前的設想更為復雜。遺傳易感性、環境暴露及表觀遺傳的改變共同影響疾病發生、發展，而表觀遺傳年代開啟了PBC新的研究方向，進一步加深了對這一復雜疾病的認識。