雜交鏈反應在超靈敏檢測方面的應用進展*

趙云虎，覃曉琳，楊結儀，陳文韜，廖儀文 綜述,鄭和平△ 審校

(1.安徽醫科大學，安徽合肥 230000；2.廣東省皮膚病醫院檢驗科，廣東廣州 510000)

現代醫學領域，許多疾病的診斷和治療都依賴一定的檢測技術，無論是分子水平的核酸和蛋白質，還是細胞水平的分析都需要高靈敏度高特異度的技術來提高檢測的準確性。目前，臨床常用的檢測手段主要包括核酸擴增，免疫熒光，化學發光，比色法，免疫層析，酶免疫，直接鏡檢等，其中核酸擴增被認為是高靈敏高特異的檢測技術之一[1]。現在的核酸擴增技術已經非常完善，主要分為兩大類：熱循環擴增和等溫擴增。熱循環擴增包括聚合酶鏈反應(PCR)，連接酶鏈式反應(LCR)等；等溫擴增包括滾環擴增(RCA)，鏈置換擴增(SDA)，雜交鏈反應(HCR)等[2-5]。相對于熱循環擴增，等溫擴增外部條件要求更簡單，不需要額外的儀器輔助變溫，甚至可以在室溫下反應，其中以HCR為基礎的等溫擴增得到人們的廣泛關注[6]。

2004年，DIRKS等[7]首次提出HCR，一種無酶、高敏、簡單、高效能、不依賴儀器的等溫擴增技術。HCR是通過一段核酸引發物(NI)使兩條發夾DNA(H1、H2)互相雜交的級聯反應，形成穩定的長雙鏈DNA，通常由幾十個甚至上百個重復單位(H1、H2)互補配對形成，對H1、H2進行標記可實現檢測信號的增強或放大，如熒光標記、電化學標記、納米粒子標記等[8-10]。迄今為止，HCR已經應用于多種靶目標的超靈敏檢測，包括核酸、蛋白質，甚至在腫瘤細胞中也有一定的應用[11-16]。除了靶目標的檢測，HCR還可以聯合識別分子，實現原位或細胞內成像，應用于疾病的診斷和治療[17-18]。本文首先介紹了HCR的基本原理和設計原理，然后從核酸檢測、蛋白檢測、細胞檢測及生物成像等方面介紹了HCR的應用進展。

1 HCR基本原理

2004年，DIRKS等[7]首次提出HCR的基本概念，利用DNA與基質的結合，同時進行識別和信號放大作用的創新性技術。HCR主要是通過一段核酸引發物(NI)識別并引起發夾核苷酸(H1、H2)互相雜交，形成長雙鏈DNA的串聯級聯反應。H1由a、 b、 c、b′構成，H2由c′、b、a′、b′構成(H1、H2先經高溫變性冷卻后形成發夾結構)，NI由b′、a′構成。當NI不存在時，H1、H2可保持穩定；當NI存在時，通過互補配對與H1末端結合，打開H1發夾，暴露c、b′。暴露部分與H2末端互補，打開H2發夾暴露a′、b′(與NI序列相同)，從而持續打開H1和H2進行HCR，形成長雙鏈DNA。DIRKS等[7]指出HCR產物的長短與加入NI量成反比。

2 HCR設計原理

常規的NI設計，可根據靶核酸序列選擇其某段特異性單鏈序列，一般為24 bp(前18 bp為b′，后6 bp為a′)；H1一般為48 bp，根據NI互補序列獲得a、b、b′序列，其環結構c需額外設計；H2與H1一樣長，可通過H1互補序列和NI獲得c′、b、a′、b′[19]。MITI等[20]在常規的HCR設計原理的基礎上，描述了另一種自組裝反應觸發特定核酸靶標，用于檢測不同核酸溶液中的靶目標，極大的提高了靈敏度。設計過程中需要遵守一些原則[21]：(1)末端(a、c′)的GC比例應在30%～40%以下；(2)末端長度應在12 bp以下，否則會影響發夾結構的穩定性；(3)莖長度(b、b′)應大于末端長度以保持發夾結構的穩定性；(4)發夾序列(H1、H2)總體的GC比例應大于60%。

3 HCR的應用

與傳統的PCR相比，HCR是一種等溫的、無酶的擴增技術。HCR和PCR主要不同點在于，HCR是一種引物擴增而PCR是一種產物擴增技術[22]。因此，HCR可以有效地減少非特異性擴增，減少假陽性結果，降低交叉污染，提高檢測靈敏度。

3.1核酸檢測 核酸是疾病早期診斷中特異的標志物，高敏高特異檢測核酸對臨床的診斷和治療具有極大的意義。SONG等[8]利用β-CD對芘的熒光增強及靶DNA引發HCR，實現了靶DNA無酶高靈敏檢測。其中，芘標記H2為信號源，由于β-CD與帶負電荷的H2存在很強的靜電作用，芘較容易進入β-CD腔，因此熒光信號明顯增強。而當靶DNA存在時，H2參與HCR形成長雙鏈DNA，由于空間位阻作用使芘難以進去β-CD腔，因此熒光信號弱，其檢測限可達0.1 nmol/L。LU 等[23]通過HCR觸發的酶級聯反應建立了一種超靈敏比色法，H1和H2上分別標記葡萄糖氧化酶(GOx)和辣根過氧化物酶(HRP),經HCR提高了GOx/HRP的催化作用，實現了對靶DNA最低檢測限達5.2 fmol/L。MA等[11]利用DNA修飾膠體金作為捕獲探針，通過與靶DNA互補結合，暴露末端引發H1/H2級聯反應。此時膠體金表面的長雙鏈DNA可以抵抗鹽離子誘導膠體金的聚集作用，使得溶液呈紅色。反之，若不存在靶DNA，HCR不能發生，鹽離子誘導使膠體金聚集呈藍色。此方法具有超高靈敏度和特異度，檢測限可達0.5 nmol/L。

HCR同樣可應用于固相支持物表面，如電極，玻片，納米粒子，微孔，微流體等，將分析物同復雜的樣品體系分開。 YING等[12]用FAM標記捕獲探針，靶DNA引發生物素化H1/H2(Bio-H1,Bio-H2)級聯反應，HCR產物與樣品墊上的親和素化膠體金(AuNP-SA)結合，層析時被檢測線上包被的FAM抗體捕獲，可直接觀察陽性結果。檢測限低至1.76 pmol/L，比沒有HCR擴增的層析低約2個數量級。CHEN等[9]把自催化鏈置換擴增(ASDA)與HCR巧妙的結合，可進行無標記和多重放大檢測核酸。ASDA期間，利用DNA聚合酶和內切酶對固定發夾探針和輔助DNA鏈的連續聚合、切開，回收大量中間DNA序列，從而催化鏈置換擴增。同時，ASDA產物與H1/H2進行HCR，形成富含胞嘧啶環的長雙鏈DNA，從而增多銀納米的聚集，增強電化學信號，其檢測限可達0.16 fmol/L。

3.2蛋白質檢測 蛋白質同樣也是疾病診斷中重要的標志物，然而在臨床樣本中許多靶蛋白的豐度偏低，因此高敏高特異檢測靶蛋白同樣也是人們關注的重點。CHOI等[24]以熒光標記H1/H2，通過與抗體偶聯的NI進行HCR，檢測單核細胞分泌的細胞因子和趨化因子。相對于無HCR的免疫熒光，免疫-HCR的檢測限和靈敏度提高近200倍。HOU等[13]將抗體和NI同時包被于納米金上形成Ab-AuNP-NI復合物，具有多個NI引發部位，可引發多個HCR產物包被于同一個納米金上，通過電化學信號檢測癌胚抗原(CEA)，線性范圍為1.0 pg/mL～20.0 ng/mL，檢測限可達0.42 pg/mL。XU等[14]將納米碳標記H1/H2，與檢測抗體偶聯的NI引發HCR，通過HCR放大效應及金屬增強熒光(MEF)構建了一個雙擴增熒光傳感器檢測甲胎蛋白(AFP)，線性范圍為0.000 5～5 ng/mL，檢測限可達94.3 fg/mL。

除了抗體外，適配體也能夠高親和高特異識別靶蛋白。適配體是一種短鏈單鏈DNA或RNA，因此可作為NI參與HCR，用于檢測蛋白質。 WANG等[25]利用氧化石墨烯(GO)對ssDNA和dsDNA的親和性不同，分離H1/H2和HCR產物，從而提高檢測靈敏度。當靶蛋白存在時，適配體識別靶蛋白并改變自身構象，引發H1和H2級聯反應形成長雙鏈DNA。而GO分離作用純化了HCR產物，通過熒光染料SYBR Green結合雙鏈DNA小溝，達到提高靈敏度的效果，該方法的檢測限可達1.25 pmol/L。 NIE等[26]通過適配體識別被磁珠抗體捕獲的卵巢癌標志物CA125抗原，適配體引發納米金標記H1和游離H2形成樹枝狀的長鏈，再利用鉬酸根與DNA磷酸酯基團的氧化還原反應，大量的磷酸集團增加了電化學信號，使得檢測靈敏度顯著增強，檢測限可達50 μU/mL。

3.3腫瘤細胞檢測 腫瘤細胞的某些分子標志物的表達水平與正常細胞有很大的不同，通過檢測這些差異性表達的標志物有利于臨床早期診斷和治療癌癥。LI等[15]針對胃癌患者血清中microRNA-21設計H1/H2，當microRNA-21存在時引發HCR，并通過SYBR GreenⅠ染料插入HCR產物作為信號，建立了無標記熒光檢測模型，具有強熒光密度。其線性范圍為1～105fmol/L，miRNA檢測限可達0.255 4 fmol/L。YANG等[27]利用Au-S鍵將捕獲探針固定在金電極表面，探針、靶DNA和(NI)雜交形成“三明治”結構，然后NI引發HCR形成長雙鏈DNA，最后通過RuHex與長雙鏈DNA的靜電吸附作用產生電化學信號的改變。這種以HCR為基礎的電化學物傳感器可以精準的檢測I型乳腺癌基因，檢測靈敏度低至1 amol/L。

已有研究表明，可通過直接檢測腫瘤細胞膜表面分子標志物來診斷癌癥，有效的避免了裂解細胞和提取靶目標以檢測核酸和蛋白，提高了檢測的效率。ZHANG等[28]先將適配體序列(DNAa)和信號DNA(DNAb)部分互補雜交，當靶細胞存在時，適配體特異性識別腫瘤細胞表面分子，構象改變使DNAb游離。DNAb可引發H1/H2級聯反應，形成長雙鏈DNA可作為強熒光效應的銅粒子(CuNPs)的載體，從而實現了無酶定量檢測腫瘤細胞，其檢測限達50個細胞。ZHOU等[16]先將捕獲探針修飾到金電極表面，適配體通過部分互補的(NI)進行HCR，HCR中的H1和H2經特殊設計，形成的長雙鏈DNA含有許多分支序列，該分支序列與捕獲探針完全互補，因此提供了大量的捕獲位點。當腫瘤細胞存在時，經適配體的特異性識別及分支序列和捕獲探針互補雜交作用，可超靈敏捕獲腫瘤細胞，檢測乳腺癌MCF-7細胞的檢測限可達4個細胞。

3.4生物成像 熒光原位雜交(FISH)是通過識別細胞或組織內的靶RNA，直接觀察RNA的表達量和分布，以闡明相關病理過程和臨床診斷。然而單個熒光標記探針的熒光強度較弱,CHOI等[29]通過熒光標記H1/H2進行HCR-FISH，HCR產物能提供大量的熒光信號，HCR-FISH比FISH的熒光強度增強近200倍。YAMAGUCHI等[30]比較HCR-FISH與CARD-FISH和標準FISH檢測環境中的微生物，認為HCR-FISH不但具有高特異性的強熒光信號，其檢出率也優于其他的FISH，可用于單個微生物細胞檢測。 HUANG等[31]利用熒光共振轉移(FRET)結合HCR-FISH的方法，避免了FISH中反復沖洗的過程，消除了探針積累或退化引起的假陽性信號。主要通過3個發夾結構(H1、H2、H3)的相互作用產生FRET信號，其中H2/H3兩端均標記TAMRA和FAM，H1識別靶mRNA后暴露末端引發H2/H3介導的HCR，從而增強FRET信號，操作簡單易行，節約時間。

除了應用于FISH成像，HCR還可以運用于活細胞成像。WU等[32]將FAM和TMR分別標記在H1/H2上，再包被于肽化納米金形成復合體，復合體可通過胞吞作用進入胞內。由于TMR的熒光吸收使胞內僅有很弱的熒光信號，當靶mRNA存在時，引發HCR使H1/H2與納米金分離，恢復FRET信號并增強細胞內成像。OU等[17]利用MnO2載體吸附H1/H2并送入活細胞內，MnO2被胞內谷胱甘肽降解，釋放H1/H2。然后通過胞內miRNA觸發HCR，HCR產物上每兩個FAM和一個TAMRA靠近產生顯著增強的DD-A FRET信號，檢測限高達9.8 pmol/L。LIU等[18]報道了一種分枝HCR用于活細胞內mRNA的高效信號放大成像，分枝HCR能夠通過單個NI引發的分枝產物定位活細胞中單個靶分子，結果顯示強烈的熒光斑點，其檢測限可達500 fmol/L。ZHANG等[33]把端粒酶引物序列和HCR引發物組成復合體，并轉染到細胞質中。當端粒酶存在時，復合物被識別，產生大量的NI，然后與H1/H2形成具有大量側鏈的長雙鏈DNA，可被復合物Q識別，產生增強信號，用于檢測細胞裂解物中的端粒酶活性，檢測限可達578個細胞/100μL。HUANG等[34]利用鏈霉親和素結合生物素化的H1/H2，分別形成發夾DNA四聯體，其中H1攜帶Cy3，H2攜帶Cy5。兩個四聯體均可高效的進入細胞內，并形成交聯網絡狀結構，可特異性識別靶miRNA，極大地提高了靈敏度和空間分辨率，同時利用FRET的雙發射比率成像，有效降低假信號的干擾。

4 小 結

通過以上綜述可以看出，無酶等溫擴增的HCR已廣泛地應用于檢測、成像和生物醫學，但HCR的應用仍面臨許多挑戰。合適的H1/H2是HCR中的關鍵因素，H1/H2設計不完善可能會導致HCR失敗，而目前仍缺乏公認的系統性發夾結構設計指南。由于以核酸形式存在的適配體能夠識別蛋白質、小分子及細胞，極大地促進了HCR的發展，然而可供選擇的適配體不多，極大地限制了適配體-HCR體系。對于在固相支持物表面采用HCR，如何控制核酸探針的密度和方向是目前需解決的難題之一，否則易導致非特異性吸附和集群效應，限制HCR的效能。在生物成像和生物醫學方面，由于核酸的大小和電荷作用，攜帶成像試劑或治療藥物的HCR產物難以進入胞內，僅有少量的適配體可通過胞吞進入胞內，極大的限制了胞內成像和靶向治療。另外，高分子量的HCR產物對正常細胞有一定的非特異性吸附，可能會造成假陽性信號或殺死正常細胞和組織，而且胞內對靶向藥物缺乏有效和精準的釋放機制，以至于降低治療效果?，F如今，以HCR為基礎的應用多停留在實驗室階段，其實際應用仍然是個挑戰，進一步研究HCR需建立在臨床應用的基礎上，簡單而靈敏的POCT可作為未來研究HCR的方向之一。

盡管面臨許多挑戰，但無酶等溫擴增的HCR體系能夠綜合各種各樣的納米材料、復合物和分析技術，促進DNA納米技術的發展，加強這些方法在臨床診斷、治療、防控等方面的實際應用。