液質聯用定量血清中維生素D、A、E的方法*

李金蓉，阮亮亮,2,3△，楊文初

(1.上海楓林醫藥醫學檢驗有限公司特檢部，上海 200031；2.上海醫藥臨床研究中心，上海 200031；3.上海生物樣本庫工程技術研究中心，上海 200031)

脂溶性維生素是人體必需的營養成分，在人體的生理、病理上起著至關重要的作用。越來越多的研究證據表明，脂溶性維生素A、D、E與人體多種生理代謝性疾病相關聯。最近的大量研究表明，維生素D缺乏除會引起傳統認識到的兒童佝僂病外[1]，還與冠心病，糖尿病，小兒頭疼，癌癥等眾多疾病關系密切[2-5]。維生素D的檢測已成為目前最為活躍的疾病標志物檢測領域之一。維生素A除與視力的發育及功能，性腺功能等有關外[6-7]，最新研究表明，維生素A在慢性的移植抗宿主疾病中具有改善皮膚的纖維化的功效[8]。維生素E作為抗氧化劑，普遍認為具有抗衰老的作用，最新發現維生素E缺乏也會導致卵巢激素的缺乏，從而會引起相關的疾病[9-10]。目前，檢測維生素的方法主要有免疫分析法、高效液相色譜法、液質聯用LC-MS/MS法等[11-13]。LC-MS/MS方法相比于免疫分析法具有特異性和靈敏度高等優點。因此，液質聯用的方法已經廣泛被運用在測量生物標記物方面。現今，已經有部分研究運用液質聯用的方法同時分析脂溶性維生素A、D、E[14-16]。這些方法，在分析時間、靈敏度、方法成本等方面尚有諸多不足。此外，這些維生素是人血清內源物質，無法找到不含這些分析物的人空白血清配制校正標準做定量標準曲線，從而增加了一般方法的臨床應用難度。本文首次提出并驗證了以代替基質為基礎的LC-MS/MS法，在5 min時間里完成了四種成分的同時準確定量，節省了試劑成本和時間成本。通過方法學驗證，證明了方法適用于人血清中25-羥基維生素D2(25OHVD2)、25-羥基維生素D3(25OHVD3)、維生素A、維生素E的同時定量。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 液相色譜為LC20AD XR HPLC pumps 及SIL-20AC XR 自動進樣器；質譜為AB Sciex QTrap5500型質譜儀。分析天平為賽多利斯公司CPA225D型；氮吹儀為Zymark公司Turbo Vap型；多管渦旋振蕩器為Scientific Industry公司產品；離心機為Thermoscientific公司CL31R型。25OHVD2、25OHVD3、2H3-25-Hydroxy維生素D2、2H6-25-Hydroxy維生素D3購買自IsoSciences公司；維生素A購買自Sigma-Aldrich；維生素E購買自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；2H6-Retinol，購買自ISOREAG公司；維生素E-d6：購買自Toronto Research Chemicals公司。試劑如環己烷、甲醇、甲酸，甲酸銨均購買自sigma-Aldrich公司。水為Millipore生產雙蒸水。

1.2方法

1.2.1工作液的配制 四種化合物的標準曲線工作液(SWS1～SWS8)及最低檢測線、低、中、高4個水平的質控工作液(QWS-LL、QWS-L、QWS-M、QWS-H)，按表1中濃度由高濃度逐級溶劑稀釋配制。

表1 標準曲線工作液和質控工作液名稱和濃度(ng/mL)

1.2.2代替基質及其效能的平行試驗驗證

1.2.2.1代替基質及其配制按本實驗室自行開發的方法配制 代替基質由實驗室易得的化學品配制而成。

1.2.2.2平行試驗驗證 (1)取6份至少6個不同來源的混合血清，添加工作液，對得到的樣品進行標準加入法分析，外推得到本底濃度，從而得到各點的理論濃度，此數據用作為濃度的參照值。(2)用代替基質做標準曲線，對上述樣品進行定量，測得濃度；(3)計算代替基質測定結果的準確度，從而驗證代替基質的可行性。

1.2.3質控樣品的配制

1.2.3.1分析批代替基質質控的配制 分析批質控樣品包括最低檢測線質控(LLOQ)、低濃度質控(LQC)、中濃度質控(MQC)和高濃度質控(HQC)4個水平，由表1中各質控工作液25 μL依次加入到100 μL替代基質中配制而成。每個分析批次均新鮮配制。

1.2.3.2血清質控樣品的配制 高血清質控樣品(HQC-Sr)是將標曲工作液中的最高濃度點以工作液∶血清=1∶20的比例加入血清中混勻所得。中血清質控樣品(MQC-Sr)為血清樣品測試得到的本底濃度。

1.2.4樣品處理

1.2.4.1校準曲線及批內質控品的處理方法 25 μL標曲工作液，或代替基質質控工作液分別加入100 μL替代基質中，加入200 μL內標溶液，渦旋混勻，加入900 μL環己烷，渦旋5 min，高速離心5 min；轉移800 μL上清至另一離心管，氮氣吹干；加入100 μL 80%甲醇水溶液復溶，渦旋離心后，取上清進樣分析。

1.2.4.2血清樣品的處理方法 25 μL甲醇加入100 μL血清樣本中，加入200 μL內標溶液，渦旋10 s，加入900 μL環己烷，渦旋5 min，高速離心5 min；轉移800 μL上清至另一離心管，氮氣吹干后加入100 μL 80%甲醇水溶液進行復溶，渦旋離心后，取上清進樣分析。

1.2.5LC-MS/MS方法參數 實驗使用APCI離子源，多反應監測模式(MRM)進行選擇離子掃描定量，質譜參數如下。霧化氣(Gas 1)：70 psi；噴霧電壓：3 V；氣簾氣(CUR)：25 psi；碰撞氣(CAD)：Medium；離子源溫度(TEM)：550 ℃。各化合物及其內標的過渡離子對如下，25OHVD3：383.4→365.3，25OHVD2：395.3→209.1，維生素A：269.0→93.0，維生素E：431.4→165.2；d3-25OHVD2：398.3→230.2，d6-25OHVD3：389.4→371.3，維生素E-d6：437.5→171.1，維生素A-d6：275.1→175.8。液相分離選用Thermo scientific公司Accucore色譜柱C18，50×2.1 mm，2.6 μm；流動相A為0.2%甲酸-1 mmol/L甲酸銨甲醇溶液，流動相B為0.2%甲酸-1 mmol/L甲酸銨水溶液；流速：0.5 mL/min；柱溫：40 ℃，自動進樣器溫度：4 ℃。洗脫步驟如下：0～1.5 min有機相比例從70%升至95%，保留1.8 min，然后在0.2 min時間內升至100%有機相，保留1.6 min，之后回到初始有機相比例，停留0.5 min。最終在5 min時間里完成分析。代表性的圖譜見圖1。樣品濃度分別為25OHVD2:20 ng/mL,25OHVD3:80 ng/mL,維生素A:4 000 ng/mL,維生素E:12 000 ng/mL。

2 結 果

2.1代替基質的可行性平行試驗驗證 如表2所示。內源性物質常規的定量方法為標準加入法，此測定結果在這里作為參照標準。用代替基質所做的標曲，得到相關系數r>0.990 0。用此標曲定量標準添加法的樣品，得到的值與標準加入法對比，以評價代替分析物的可用性。4種化合物的用替代基質測定的偏差均在±20%以內。由此證明所配制的替代基質可以作為定量真實血清樣本的替代基質，結果可靠。

2.2血清基底值測試 方法的可靠性必須通過真實的血清質控品來驗證。本實驗中以替代基質配制四個水平LLOQ、LQC、MQC、HQC的質控和兩個水平的真實血清質控MQC-Sr(混合血清本底值)/HQC-Sr(標準加入一定量的混合血清值)各平行6份，按照樣品前處理方法處理。上機測試得到血清MQC/HQC的實測濃度值。此值作為后期日內及日間準確度與精密度及穩定性測試的標準值。加入此兩個水平的質控樣本的目的一是為了說明方法適用于臨床真實樣本的測試，另一方面也說明了混合了不同來源的人血清樣本中幾乎不含對定量有干擾的物質。說明方法具有特異性。各化合物血清本底測試值由于篇幅限制未呈現。

2.3日內及日間準確度與精密度 為了考察方法的日內及日間準確度與精密度，配制了6個水平的質控品考察實測值與理論值之間的偏差。分別在3個不同的分析批及不同天對6個水平的質控品進行比較。根據測試結果，準確度與精密度的偏差均在±20%以內，符合生物樣本分析的評判標準。見表3。

圖1 4種化合物在5 min的LC-MS/MS的代表性色譜圖

樣品名稱標準加入后的理論值A(ng/mL)25OHVD225OHVD3維生素A維生素E替代基質標曲測量值B(ng/mL)25OHVD225OHVD3維生素A維生素E使用替代基質的誤差(%)25OHVD225OHVD3維生素A維生素ESAS 01.2532.24 7807 3101.1125.64 5008 640-11.1-20.1-5.918.2SAS 146.30212.013 80034 30044.90202.012 90034 200-2.9-4.8-6.4-0.3SAS 236.30172.011 80028 20037.70146.010 80032 2004.0-15.2-8.313.7SAS 326.30132.09 78022 30028.60123.09 16023 7009.0-7.0-6.46.2SAS 413.8082.27 28014 80015.5065.77 36014 80012.7-20.11.1-0.1SAS 53.7542.25 2808 8104.0338.54 9109 2007.5-8.9-7.14.4

2.4穩定性

2.4.1儲備液穩定性 實驗中考察了儲備液在-20 ℃冰箱1個月的穩定性，結果符合新舊比對偏差在±10%以內的評判標準。此外，還考察了儲備液在室溫放置6 h的穩定性，結果也符合差異±10%以內的評判標準，說明使用的儲備液在一個月的時間內是保持穩定的，且室溫放置6 h及以內不會影響檢測結果。

2.4.2工作液的室溫穩定性 接近LLOQ的濃度點放置在室溫6 h，與新鮮配制的相同濃度點比較，結果符合偏差在±10%以內的評判標準。本實驗中使用的工作液自開始驗證配制后儲存在-20 ℃冰箱到完成驗證實驗1個月的時間里保持穩定，說明工作液在1個月的時間里是穩定的。由此，方法中使用的工作液放置在室溫 6 h及以內，以及儲存在-20 ℃冰箱1個月時間均不會對結果產生顯著影響。

2.4.3短期穩定性 考察替代基質質控LQC和HQC及血清質控MQC-Sr和HQC-Sr共四個水平在室溫放置24 h的穩定性。由實驗結果得知，250HVD2，25OHVD3及維生素E三種成分的替代基質質控和血清質控在室溫放置24 h均穩定。維生素A替代基質質控在室溫放置24 h不穩定，每次分析需要新鮮配制。而血清質控是穩定的，說明真實樣本即使在室溫放置24 h依然呈穩定狀態。限于篇幅，數據未列出。為了考察維生素A替代基質質控品的穩定性狀態，接著又考察了其2、4、6 h,穩定性。由數據發現，維生素A在2 h里都會有近30%的降解，進一步說明維生素A的替代基質質控需新鮮制備，不適用于室內保存。

2.4.4凍融穩定性 考察了血清MQC-Sr和HQC-Sr兩個濃度水平，將早先配制好儲存在冰箱的HQC-Sr及MQC-Sr放置室溫解凍后，再次存儲回-20 ℃冰箱冷凍至少12 h以上再次解凍，依次循環3次考察其經過3次凍融循環后濃度與理論濃度之間的偏差。經過試驗，得知血清在經過3個凍融循環后，依然可以保持穩定。不影響檢測結果。滿足生物分析方法學±20%以內的評判標準。限于篇幅，數據未列出。

2.4.5長期穩定性 考察了真實的血清質控品放置在-20 ℃冰箱1個月的穩定性狀態。由于短期穩定性考察中維生素A替代基質質控品在室溫放置不穩定，這里還考察了替代基質質控品在-20 ℃冰箱放置3 d的穩定性。由表4得到，血清質控在-20 ℃冰箱放置1個月的時間里仍然穩定，且4種成分的替代基質質控放置在-20 ℃冰箱3 d時間里也是穩定的。

表3 日內及日間準確度與精密度(%)

表4 4種化合物的長期穩定性(n=6)

續表4 4種化合物的長期穩定性(n=6)

3 討 論

同時高效、精確定量人血清中25OHVD2、25OHVD3、維生素A、維生素E四種脂溶性維生素是一挑戰性課題。原因一，四種物質在血清中含量分布很寬，從25OHVD2的納克級以下，到維生素E的微克級以上，因此要求方法的線性范圍寬。本方法即可靈敏地定量到低濃度的25OHVD2，也可檢測到高濃度維生素E；原因二，作為內源性化合物的空白基質的不可得到性。市面上尚無包含這四種維生素的標準品和質控品，即使有，方法的成本也會很高，直接影響方法的廣泛應用性。對內源性生物標志物的定量，如果空白基質無法得到，通常采取代替分析物或代替基質法。以同位素為基礎的代替分析物法，盡管方法發展較容易，但成本較高，而且后續樣品分析因不可用標曲直接定量而較麻煩。選用代替基質法，一旦代替基質的可用性得到證明，方法應用到樣品分析則如常規定量分析一樣，無附加步驟。但代替基質需反復篩選，以期其性能滿足分析要求。經過大量篩選優化實驗，本實驗室制得了一種易得且性能可靠的代替基質。通過實驗，其可用性得到證實。該方法使用了自配易得的替代基質來制備校準品和質控品，縮減了成本，提高了經濟效益，使得方法更加實用。其三是方法的靈敏度和樣品用量。由于25OHVD2的濃度很低，為達到準確定量，一般報道的方法樣品用量都較大。而本方法只需100 μL血清就能達到較低的檢測限，完全滿足臨床樣本的分析要求，減輕了患者的痛苦。經過方法學驗證，證明了該方法具有靈敏度高、可靠、穩定、耐用、快速等優點。本方法適用于臨床樣本的分析。目前該方法已在本實驗室服務于臨床樣品分析。