膽道閉鎖早期診斷的研究進(jìn)展*

呂艷關(guān) 綜述，劉穎穎 審校

(揚(yáng)州大學(xué)附屬淮安市婦幼保健院：1.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科；2.新生兒醫(yī)學(xué)中心,江蘇淮安 223002)

膽道閉鎖(BA)是新生兒較常見(jiàn)的嚴(yán)重肝臟疾病之一，患兒肝內(nèi)外膽管發(fā)生進(jìn)行性炎癥和纖維化，導(dǎo)致肝內(nèi)膽汁淤積、肝臟纖維化及硬化，臨床表現(xiàn)為黃疸、白陶土樣大便、尿色加深等，如果不予治療，患兒大多數(shù)會(huì)在一年內(nèi)因?yàn)楦喂δ芩ソ叨劳?。目前肝門(mén)空腸吻合手術(shù)(Kasai手術(shù))是該病除了肝移植以外的唯一治療方式，大多數(shù)患兒可通過(guò)Kasai手術(shù)獲得膽汁引流，如手術(shù)后膽汁引流效果不好，在出現(xiàn)肝功能衰竭時(shí)再進(jìn)行肝臟移植。多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為Kasai手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)是出生后60 d以內(nèi)，但由于缺乏敏感、準(zhǔn)確的檢查手段，導(dǎo)致很多患兒不能得到及時(shí)的治療，致使該病預(yù)后不理想，因此，其最大的挑戰(zhàn)是盡量在生命早期進(jìn)行該病的篩查和診斷。術(shù)中膽道造影是診斷膽道閉鎖的金標(biāo)準(zhǔn)，但該檢測(cè)方法創(chuàng)傷較大。因此，尋求一種特異度和靈敏度高、無(wú)創(chuàng)或創(chuàng)傷性小的早期診斷BA的方法十分重要?，F(xiàn)對(duì)近年來(lái)膽道閉鎖診斷方面的最新進(jìn)展進(jìn)行概述，以期為臨床實(shí)踐和研究提供借鑒和參考。

1 血液來(lái)源的生物標(biāo)記物

1.1常見(jiàn)的相關(guān)肝功能指標(biāo) 雖然幾乎所有肝功能指標(biāo)在BA中均可出現(xiàn)異常，特異性欠佳，但目前肝功能檢查對(duì)診斷BA仍有重要意義。對(duì)BA有輔助診斷意義的指標(biāo)有很多。(1)反映肝臟合成功能的指標(biāo):總蛋白、清蛋白等主要由肝臟合成，當(dāng)出現(xiàn)肝臟病變引起肝細(xì)胞受損時(shí)肝臟合成功能下降，總蛋白、清蛋白等在血清中的濃度也隨之下降；(2)反映肝細(xì)胞受損的指標(biāo)：臨床上常用于反映肝細(xì)胞受損的肝功能指標(biāo)有丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)等，以上酶廣泛分布于肝細(xì)胞中，當(dāng)肝細(xì)胞受損或壞死時(shí)進(jìn)入血液，通過(guò)測(cè)定血清中含量即可反映出肝細(xì)胞受損的情況。對(duì)于BA患兒，病變?cè)缙谶@些指標(biāo)可正常，隨著病情進(jìn)展表現(xiàn)為輕中度升高。2003年WAI等[1]建立了APRI模型即(AST與血小板的比值)，大量研究顯示該比值與肝臟纖維化分級(jí)成正相關(guān)，APRI在判斷淤膽性肝臟纖維化方面有較高的可靠性，對(duì)于膽道閉鎖肝纖維化的診斷敏感性及特異性分別可達(dá)到79%、88%[2-5]；(3)反映肝纖維化指標(biāo):有研究表明，血清透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、三型前膠原N端肽(PⅢNP)及Ⅳ型膠原(CⅣ)的水平變化可反映肝纖維化及肝硬化的程度[6-8]；(4)反映膽紅素代謝及肝臟膽汁排泄、淤積、分泌功能指標(biāo)：臨床常用指標(biāo)有總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、間接膽紅素(IBIL)及總膽汁酸、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)及堿性磷酸酶等。膽紅素因其檢測(cè)方便快捷、價(jià)廉，是目前用于篩查BA最廣泛的血液生化學(xué)指標(biāo)。POWELL等[9]研究表明，血清結(jié)合膽紅素用于篩查新生兒肝病的敏感性和特異性分別為100%和99.6%。微量血經(jīng)皮及點(diǎn)片法檢測(cè)直接膽紅素水平，是早期篩查膽道閉鎖的常用方法；血點(diǎn)片法檢查新生兒(<2周)直接膽紅素水平持續(xù)高于50 mg/L時(shí)，提示新生兒膽汁淤積癥可能性大[10]；經(jīng)皮測(cè)定膽紅素水平(TcB)無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)單易行，可檢測(cè)血清總膽紅素，如果TcB測(cè)定顯示黃疸持續(xù)3周及以上，應(yīng)持續(xù)監(jiān)測(cè)并進(jìn)行相關(guān)的檢查來(lái)進(jìn)一步除外膽道閉鎖。膽道閉鎖患兒血清初級(jí)結(jié)合膽汁酸增高，且?；悄懰釢舛燃翱偰懼釢舛让黠@高于非BA膽汁淤積癥患兒及健康對(duì)照組，故測(cè)定血清各種膽汁酸濃度可用于膽道閉鎖的早期篩查[11]。FUKUOKA等[12]檢測(cè)了16名BA患兒及21名患有其他肝內(nèi)膽汁淤積癥的嬰兒十二指腸液中的總膽汁酸濃度，發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出100%的靈敏度和90.5%的特異性，可以用作術(shù)前篩查以排除BA。有研究者對(duì)1 469名懷疑患有BA的患者進(jìn)行膽管造影和/或手術(shù)探查，確診1 338名BA患者，研究比較BA和非BA患者的術(shù)前醫(yī)療記錄，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BA組術(shù)前總膽紅素、直接膽紅素和GGT水平顯著升高(P<0.05)，而非BA組堿性磷酸酶水平較高(P=0.000 3)。該研究還指出如果使用GGT水平作為BA的診斷標(biāo)志物必須考慮年齡，GGT水平有助于在120 d之前診斷BA[13]。雖然單純的肝功能檢查對(duì)診斷膽道閉鎖缺乏特異性，但可以反映肝臟的損害程度，且這些檢查為無(wú)創(chuàng)血液檢查，操作方面，對(duì)于診斷BA有一定的臨床意義。

1.2血清miRNA microRNA(miRNA)的發(fā)現(xiàn)為疾病的早期診斷和病因機(jī)制的研究提供了新的思路。miRNA是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和翻譯的一種短鏈非編碼小RNA，與器官的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，它的異常表達(dá)參與多種疾病的病理過(guò)程[14-16]，同時(shí)因其在組織、疾病中特異表達(dá)及其血液中表達(dá)較穩(wěn)定，可以作為BA早期篩查項(xiàng)目。YANG等[17]發(fā)現(xiàn)miR-29b和miR-142-5p能夠通過(guò)調(diào)節(jié)IFN-γ基因參與膽道閉鎖的發(fā)生與發(fā)展。PENG等[18]發(fā)現(xiàn)BA患兒15種miRNA改變明顯，用84例樣本(44例BA患兒、20例非BA膽汁淤積癥患兒和20例健康對(duì)照組)驗(yàn)證其中4種miRNAs(miR-122-5p、miR-100-5p、miR-140-3p、miR-126-3p)，發(fā)現(xiàn)只有miR-140-3p升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-140-3p診斷BA的ROC曲線下面積為0.75(敏感性為66.7%，特異性為79.1%)，該標(biāo)記物可以作為早期非侵入性診斷BA的項(xiàng)目，并且提出miR-140-3p或許和BA發(fā)病機(jī)制相關(guān)聯(lián)，為BA病理機(jī)制的研究提出新思路。DONG等[19]發(fā)現(xiàn)13種miRNA改變明顯，75例樣本(45例BA，30例非-BA膽汁淤積癥)應(yīng)用熒光定量PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證其中8種miRNAs，發(fā)現(xiàn)只有4種miRNAs(hsa-miR-150-3p、has-miR-4429、has-miR-4689和hsa-miR-92a-3p)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，他們可能通過(guò)調(diào)節(jié)各自的靶基因從而參與BA的病理進(jìn)程。has-miR-4429和has-miR-4689診斷BA的ROC曲線下面積分別為0.789(敏感性為83.33%，特異性為80.00%)和0.722(敏感性為66.67%，特異性為80.00%)，他們可能作為潛在的BA早期診斷指標(biāo)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)[20]，相比于非BA膽汁淤積癥患兒，miR-200b和miR-429在BA患兒中表達(dá)明顯增加，他們可能作為BA的早期篩查標(biāo)記物。雖然類似研究有很多，但異常表達(dá)的miRNA能否作為BA的早期篩查項(xiàng)目,目前尚缺乏相關(guān)研究證實(shí)。

1.3血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物的檢測(cè) 王家祥等[21]應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)和支持向量機(jī)(SVM)的方法，篩選出m/z位于3 403蛋白質(zhì)標(biāo)記物區(qū)分膽道閉鎖和正常對(duì)照小兒的血清蛋白指紋圖譜模型，敏感性100%，特異性100%，該模型為膽道閉鎖的早期診斷方法開(kāi)拓了新方向，值得進(jìn)一步研究。2D凝膠電泳和串聯(lián)質(zhì)譜分析38例血清樣本(19例BA患兒和19例非-BA患兒)，研究發(fā)現(xiàn)：11種血漿蛋白(維生素D-結(jié)合蛋白、載脂蛋白H、甘露糖結(jié)合蛋白、α2-HS糖蛋白、甲狀腺運(yùn)載蛋白、淀粉P混合物、硫酸類肝素多糖蛋白、補(bǔ)體C3、載脂蛋白E、載脂蛋白C、補(bǔ)體因子B)中，前七種蛋白在非BA膽汁淤積癥患兒中表達(dá)更高，后四種在BA患兒中表達(dá)更高，單一蛋白標(biāo)記物無(wú)法區(qū)分BA，但是他們聯(lián)合可以區(qū)分BA和非BA膽汁淤積癥，為BA的非侵入性早期篩查提供了新方向[22]。SONG等[23]研究發(fā)現(xiàn)，ApoC-Ⅱ和ApoC-Ⅲ在BA中與其他組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，聯(lián)合這兩種標(biāo)記物對(duì)BA診斷的敏感性為95%，特異性為93%；載脂蛋白的表達(dá)與肝功能密切相關(guān)，將來(lái)可能用于BA的早期篩查和診斷。

對(duì)于上述所及的無(wú)創(chuàng)性血液檢查指標(biāo)，盡管在對(duì)膽道閉鎖診斷上有一定的參考意義，但上述血液學(xué)指標(biāo)并沒(méi)有經(jīng)過(guò)大量研究認(rèn)同，今后仍需要大量實(shí)驗(yàn)研究給予進(jìn)一步佐證。

2 糞便比色卡

糞便比色卡(SCC)將正常和異常糞便顏色真實(shí)地記錄在一張卡片上，正常包括黃色至綠色，異常包括白陶土色至淺黃色。通常做法是將卡片附在新生兒健康手冊(cè)上一起發(fā)給家長(zhǎng)，如果家長(zhǎng)發(fā)現(xiàn)大便顏色異常應(yīng)盡快與醫(yī)療機(jī)構(gòu)取得聯(lián)系，進(jìn)一步確診或排除何種原因引起的梗阻性黃疸。SCC作為篩選BA的工具，在中國(guó)臺(tái)灣和日本得到了廣泛和有效地應(yīng)用。TSENG等[24]對(duì)比了1996～2008年臺(tái)灣地區(qū)應(yīng)用糞便比色卡前后BA篩查情況，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用糞便比色卡進(jìn)行BA篩查后，疑似BA患兒住院日齡由47 d下降至43 d，Kasai手術(shù)平均日齡由51 d下降至48 d，60 d內(nèi)進(jìn)行Kasai手術(shù)的比例從68.9%提高到73.6%，提高了自體肝5年生存率。日本報(bào)告稱SCC在BA診斷中的敏感性為76.5%，特異性為99.9%[25]。使用SCC篩查，可早期施行kasai手術(shù)，術(shù)后3個(gè)月黃疸清除率明顯增高，3年和5年自體肝生存率以及總體生存率均明顯提高[26]。應(yīng)用SCC進(jìn)行篩查可以早期發(fā)現(xiàn)BA，并在合適日齡時(shí)完成Kasai手術(shù)，從根本上提高膽道閉鎖自體肝的生存狀況。

3 尿液來(lái)源的標(biāo)記物

尿硫酸化膽汁酸(USBA)檢測(cè)是一種無(wú)創(chuàng)性膽汁淤積檢測(cè)方法，研究者利用該方法通過(guò)改進(jìn)標(biāo)本采集和尿潴留的方法，用于降低假陽(yáng)性率的BA篩查和早期檢測(cè)[27]。SHINKA等[28]利用電離子質(zhì)譜分析，測(cè)定膽汁淤積和BA患兒尿液硫酸化?；悄懰猁}，發(fā)現(xiàn)其顯著增高，測(cè)定硫酸化牛磺膽酸鹽是新生兒BA的一種有效篩查方法。EL-GUINDI等[29]研究發(fā)現(xiàn)，尿膽素原在0.32 mg/dL以下的臨界值可區(qū)分BA與其他非BA膽汁淤積，敏感性為88%，特異性為72%。當(dāng)該臨界值與GGT在363 μ/L以上的臨界值相結(jié)合時(shí)，鑒別BA與其他膽汁淤積性疾病，敏感性為80%，特異性為100%。因此，尿膽素原是一種簡(jiǎn)單、無(wú)創(chuàng)、廉價(jià)、靈敏、特異的標(biāo)記物，特別是與GGT聯(lián)合應(yīng)用，可用于診斷BA。ROCCHI[30]對(duì)患有嚴(yán)重膽汁淤積性疾病(膽道閉鎖、新生兒肝炎、正常嬰兒、成人膽道梗阻)的嬰兒和成人尿中的糞卟啉進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膽道閉鎖、新生兒肝炎和成人膽道梗阻患者尿中糞卟啉的含量顯著增加，其中尿同型異構(gòu)體Ⅰ增加明顯。尿中糞卟啉，特別是異構(gòu)體分布的測(cè)定，可能是一個(gè)敏感的診斷工具。

4 影像學(xué)檢查

超聲檢查作為診斷BA重要的無(wú)創(chuàng)性工具，其準(zhǔn)確性很高，但這需要專業(yè)的醫(yī)師操作，只能在專門(mén)的兒科超聲中心檢查。超聲診斷是臨床上常用的一種診斷方式，能夠通過(guò)超聲波掃描后成像，有利于疾病的判斷，從而選擇較好的方式治療。給予超聲診斷后，與手術(shù)造影相比，其對(duì)膽道閉鎖的診斷率相對(duì)較低，肝炎綜合征的診斷與手術(shù)造影相比無(wú)明顯差異。放射性核苷酸閃爍掃描(99Tc-HIDA掃描)具有較高的敏感性，在區(qū)分BA與不同原因引起的新生兒膽汁淤積具有較高的特異性[31]。但在掃描之前需給予嬰兒苯巴比妥3 d，并且重復(fù)成像長(zhǎng)達(dá)24 h以在腸中尋找同位素活性。雖然超聲診斷對(duì)膽道閉鎖的診斷價(jià)值較高，但是在檢查中仍然需要注意以下的問(wèn)題：(1)病史采集，對(duì)于出生后1個(gè)月仍然存在黃疸和白陶土樣大便的患者可懷疑發(fā)生了此病；(2)當(dāng)患者膽總管囊腫形成時(shí)，則應(yīng)注意膽囊的形態(tài)變化和收縮情況；(3)對(duì)哺乳前后膽囊的大小進(jìn)行觀察可以判斷肝、膽管是否保持通暢等，但是在哺乳后發(fā)生收縮，則提示其肝外膽管未發(fā)生完全堵塞；(4)對(duì)肝臟進(jìn)行觀察，了解是否出現(xiàn)肝臟增大，邊緣是否光滑等，從而對(duì)是否發(fā)生肝硬化進(jìn)行判斷[32]。

BA與非阻塞性膽汁淤積(新生兒肝炎、腸外營(yíng)養(yǎng)相關(guān)性膽汁淤積等)癥狀有相似之處，所以部分醫(yī)療機(jī)構(gòu)經(jīng)過(guò)內(nèi)科觀察及藍(lán)光照射等治療會(huì)拖延診療時(shí)間導(dǎo)致手術(shù)時(shí)機(jī)的延誤。早期確診并施行手術(shù)，對(duì)其預(yù)后尤為重要。肝功能檢測(cè)需要反復(fù)取血比較其變化趨勢(shì)的做法，部分家長(zhǎng)難以接受，依從性較低，且BA的肝功能結(jié)果與其他膽汁淤積性肝病有一定重疊，單純的肝功能檢查對(duì)診斷膽道閉鎖缺乏特異性。越來(lái)越多的研究顯示，miRNA在BA的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色，血清miRNA也成為診斷BA的潛在標(biāo)志物，但其能否用于BA的早期篩查還有待臨床大樣本研究的驗(yàn)證。雖然目前miRNA尚不能應(yīng)用于臨床診斷，但隨著高通量測(cè)序方法的不斷發(fā)展和檢測(cè)技術(shù)的不斷改進(jìn)，相信會(huì)有更多與BA相關(guān)的miRNA被發(fā)現(xiàn)。血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物的檢測(cè)并沒(méi)有經(jīng)過(guò)大量研究認(rèn)同，今后仍需要大量實(shí)驗(yàn)研究給予進(jìn)一步佐證。尿液收集簡(jiǎn)單無(wú)創(chuàng)，檢測(cè)結(jié)果可以初步判斷患兒是否存在膽汁淤積癥。糞便比色卡篩查方法一方面能夠提高患兒家長(zhǎng)對(duì)膽道閉鎖的認(rèn)知，另一方面由于其操作簡(jiǎn)單，適宜推廣到各級(jí)醫(yī)院尤其是基層醫(yī)院和偏遠(yuǎn)地區(qū)。是目前國(guó)際上許多國(guó)家和地區(qū)極力推薦和最有前景的BA早期篩查方法。影像學(xué)檢查醫(yī)師應(yīng)具有一定的臨床經(jīng)驗(yàn)，才可判斷出膽囊的發(fā)育情況、膽囊的收縮能力以及肝門(mén)部位的纖維斑塊準(zhǔn)確位置。

目前，對(duì)于該病的早期診斷仍十分困難，所使用的診斷方法也形式繁多。目前我國(guó)缺乏規(guī)范、系統(tǒng)的膽道閉鎖的早期篩查項(xiàng)目，故仍然需要進(jìn)一步的研究以發(fā)現(xiàn)高特異性及敏感性、非侵入性的標(biāo)記物來(lái)早期篩查或診斷BA。