長鏈非編碼RNA與缺氧誘導因子-1在胰腺癌中相關機制的研究進展

陳鵬，周斌，劉恒健，王濤，郭衛東

（青島大學附屬醫院 肝膽胰外科，山東 青島 266000）

胰腺癌是目前世界上預后最差的惡性腫瘤之一，5年生存率不足5%[1]。隨著醫學技術的發展，胰腺癌治療方式多種多樣，針對胰腺癌的基因靶向藥物也不斷被發現并應用到臨床當中，但近20年來胰腺癌患者預后并未獲得顯著改善。因此，探索胰腺癌相關發病機制就顯得尤為重要。與其他惡性腫瘤不同的是，胰腺癌是一種乏血供并且間質豐富的腫瘤[2]。胰腺癌微環境包括非腫瘤性支持細胞和細胞外間質成分，這些非腫瘤細胞成分和周圍的基質共同包圍著腫瘤細胞，并且與腫瘤細胞相互作用共同構成了腫瘤的整體[3]。腫瘤細胞的高速復制、腫瘤源性結構以及異常增生的血管是腫瘤組織處于缺氧微環境的前提。盡管這種微環境內的低氧狀態不利于組織細胞的增殖和生存，但腫瘤細胞可以通過糖酵解水平升高、腫瘤血管增生、上皮間質轉化等一系列應激反應來維持其在乏氧狀態下的生存與生長，從而促進腫瘤遷移和傳播。此外，人類基因組的分析結果表明，有相當一部分RNA并不編碼任何蛋白質，包括核糖體RNA、環狀RNA、核內小RNA、長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和小內源性非編碼RNA等多種已知功能的RNA，還包括未知功能的RNA[4]。近年來人們發現，過去被認為不參與細胞功能的這些RNA，其實與腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移相關。最新研究表明，部分lncRNA與缺氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）在胰腺癌微環境中與腫瘤發生發展存在密切聯系[5]，從而為胰腺癌的診斷、治療和預后的判斷提供重要的指標。

1 lncRNA

lncRNA是長度大于200個堿基（kb）且缺乏顯著開放閱讀框的非編碼RNA。最初被研究者認為是轉錄過程中的“噪音”。與mRNA相比，大多數lncRNA同樣由RNA聚合酶II催化轉錄而來，結構中存在5′端帽結構和3′端多聚（A）尾，但lncRNA中不存在開放讀碼框，其序列保守程度不高且表達水平較低，組織特異性也更高[6]。最近研究發現表明，這些“暗物質”可能在胰腺腫瘤細胞發育和代謝中起重要作用[7]。lncRNA可以調節包括癌癥在內的多種疾病的應答，編碼lncRNA的基因廣泛分布于基因組中。根據模板的位置和特點，lncRNA可以分為5種類型：正義lncRNA、反義lncRNA、雙向lncRNA、內含子lncRNA和長基因間非編碼RNA。Wang等[8]將lncRNA的機制歸納為四種模型：（1）模型I（信號），反映轉錄因子及其下游信號通路對基因的調控；（2）模型II（誘餌），綁定轉錄因子，阻止與特定DNA序列結合；（3）模型III（向導），征募修飾特定靶基因的酶；（4）模型IV（支架），lncRNA可以聚集多種蛋白質并形成核糖核蛋白復合物。目前人們已經認識到lncRNA在多種疾病中都存在異常表達，隨著生物基因芯片、lncRNA與蛋白互作（RNA-proteinpulldown）和免疫共沉淀等研究技術的不斷發展，大量與胰腺癌有關的lncRNA被篩選出來，但目前僅有部分lncRNA被研究得較為清楚。

1.1 Gas5

生長抑制特異性基因5（growth arrest-specific gene 5，Gas5）近幾年才被發現，其對人類癌癥的作用受到了極大的關注和研究。Gas5是抑制腫瘤的lncRNA[9]。有充分的證據表明，Gas5在乳腺癌、前列腺癌和非小細胞肺癌的發展中起到了抑制作用。此外，有結果也發現了包含mir-21、mir-103和mir-222在內的miRNA與Gas5之間在細胞信號傳導之間存在新的聯系[10]。在胰腺癌細胞增殖中Gas5起到重要作用。Gas5可以降低胰腺癌細胞中CDK6的表達，從而使G0/G1期的細胞數量顯著降低，S期的細胞數量顯著增加。有研究發現Gas5的高表達顯著抑制了胰腺癌的發生和發展，同時伴隨著miR-32-5p下降和PTEN增加[11]。

1.2 MALAT1

人肺腺癌轉移相關轉錄物-1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript-1，MALAT1），也被稱為核富集轉錄物-2（nuclear enriched transcript-2，NEAT-2）。這種lncRNA廣泛表達于正常人體組織中，并發現在乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、肝癌和子宮癌等多種癌癥中上調。MALAT1還可以通過激發自噬促進腫瘤增殖和轉移。MALAT1與人類抗原R（hu man antigen R，HuR）的相互作用刺激HuR的表達。HuR的上調可以在轉錄水平上調節MTIA-1以促進自噬激活[12]。最近的研究表明胰腺癌患者中MALAT-1的高表達，與癌旁組織相比，癌組織中MALAT-1表達水平較高，提示MALAT-1可能是胰腺癌細胞生長和發展的致癌lncRNA之一[13]。

1.3 PVT1

漿細胞瘤變異易位體1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1）是胰腺癌易感性相關位點之一，PVT1位于人類MYC染色體8q24附近，下游57kb處，位于128806779至129113499之間。PVT1基因通過調控miRNAs、DNA重排以及與MYC基因的協同作用參與人類癌癥的發生[14]。越來越多的文獻發現，在胰腺癌細胞中PVT1與腫瘤的發生、發展存在密切聯系。Wu等[15]提出，與正常組相比，胰腺組織中PVT1表達明顯上調。PVT1可以通過下調p21的表達促進在胰腺癌細胞上皮-間充質轉化（epithelialto-mesenchymal transition，EMT）的發生。Zhao等[16]研究發現PVT1可以通過調節miR-448促進胰腺癌細胞的增殖和遷移。PVT1的高表達與胰腺癌預后不良有關，它可以通過影響ULK1的表達來影響胰腺癌的發生發展[17]。

1.4 H19

H19是一個新近發現的與胰腺癌相關的lncRNA，在胚胎組織和一系列惡性腫瘤細胞中存在過度表達，如食管癌、結腸癌、肝癌、膀胱癌和肝轉移癌等[18-19]。H19被認為在癌癥中具有致癌和抑制腫瘤的特性，H19在許多人類癌癥中上調，包括肝細胞癌、膀胱癌和乳腺癌，提示該lncRNA具有致癌功能。在結腸癌中，H19被致癌轉錄因子c-Myc直接激活，提示H19可能是c-Myc與下游基因表達之間的一種中間介質[20]。相反，腫瘤抑制基因和轉錄激活因子p53被證明可以下調H19的表達[21]。H19通過H19/let-7/HMGA2/EMT通路在胰腺癌的侵襲、轉移中發揮作用[22]。H19是目前最早應用于胰腺癌治療的lncRNA。H19可以調控表達白喉毒素A鏈的質粒載體，這種物質被稱為BC-819，具有抗腫瘤的作用[23]。在BC-819可以促進膀胱腫瘤體積減小的基礎上，Sorin等[24]進一步將BC-819與胰腺癌一線化療藥物吉西他濱聯合應用于胰腺癌動物模型中，并取得了較好的療效。

1.5 HOTAIR

HOX反義基因間RNA（HOXantisenseintergenicRNA，HOTAIR）是最早被發現以反轉錄形式調控基因表達并且與胰腺癌有關的lncRNA分子，由2185個核苷酸組成，基因序列位于染色體12q13.13的HoxC位點[25]。HOTAIR是與乳腺癌、結腸癌和肝癌患者生存相關的負向預后因子，研究證明患者中HOTAIR表達的增加與乳腺癌和結腸癌轉移的增強有關[25-26]。HOTAIR可以與PRC2和LSD1相互作用，HOTAIR 5'端（1～300 nt）與PRC2結合，3'端（1 500～2 146 nt）則與LSD1結合，以達到沉默基因的目的，進而影響腫瘤的發展[27]。相關研究證明HOTAIR在胰腺腫瘤中過表達[28]。最近，Kim等[29]通過基因分析發現，HOTAIR在胰腺癌中的表達要明顯高于癌旁組織，HOTAIR高表達的胰腺癌患者呈現出腫瘤侵襲增強、轉移范圍更加廣泛以及預后相對較差的特點。敲除Panc1和L3.6pL胰腺癌細胞系中的HOTAIR可以降低細胞增殖和侵襲能力，改變細胞周期進程并誘導凋亡[30]。此外，HOTAIR的表達與胰腺癌患者的生存時間相關，高表達者一年生存率為55%，而低表達者為91%。

2 HIF-1

HIF-1是一種由結構同源的α亞基和共同的β亞基組成的異二聚體轉錄因子，由BHLH、PAS、ODDD和TAD四個功能域組成。BHLH結構域介導靶基因與低氧反應元件和二聚體的結合。PAS結構域與BHLH組成的異二聚體蛋白功能界面。ODDD結構域為氧依賴降解部位，HIF-1a在常氧條件下通過泛素-蛋白酶體途徑降解。TAD域為末端反活化域，包括N-TAD和C-TAD，參與轉錄起始復合物的形成和轉錄的激活。在常氧條件下，HIF-1被脯氨酸羥化酶（protyl hydroxy-lases，PHD）在脯氨酸殘基402或564上羥化。在羥化后，脯氨酸殘基能被希佩爾-林道腫瘤抑制蛋白（von hippe-lindau tumor suppressor protein，PVHL）識別。泛素化的HIF-1通過蛋白酶體途徑迅速降解[31]。然而，在低氧條件下，PHD活性被抑制。HIF-1α與HIF-1β積累并二聚化，形成活性HIF-1復合物[32]。先前的研究表明，低氧條件下的HIF-1能上調葡萄糖轉運蛋白和糖酵解酶的表達。HIF-1通過調節糖酵解酶、乳酸脫氫酶和丙酮酸脫氫酶激酶的表達從而下調線粒體耗氧量，誘導腫瘤細胞對缺氧狀況的適應。當氧氣水平不能支持線粒體氧化磷酸化時，HIF-1會下調線粒體氧的消耗，并通過丙酮酸脫氫酶激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase 1，PDK1）抑制線粒體功能。隨著細胞內氧氣水平的降低，ATP的產能途徑從氧化磷酸化途徑轉變為不依賴氧氣的糖酵解途徑[33-34]。在ATP的產生中，糖酵解比氧化磷酸化效率低。然而，由于糖酵解酶活性的增加，使得葡萄糖酵解可以維持細胞內ATP的供應，從而為腫瘤細胞在缺氧狀態下提供足夠的能量供應[35]。從另一方面來講，糖酵解這種供能方式也可以減少有氧代謝中活性氧對細胞DNA的破壞，從而間接的對腫瘤細胞起到保護作用。糖酵解酶的表達水平隨缺氧程度的升高而升高，此外，也隨著乳酸產物的堆積而表達增加。細胞內PH水平可以影響調節細胞增殖、遷移的信號轉導。HIF-1在調節細胞內PH上起到關鍵作用。有研究表明，缺氧條件下HIF-1的過度表達導致NHE1基因表達和增加，從而提高Na+/H+質子泵交換活性，進而調節細胞內PH[36]。

EMT是黏附上皮細胞向可運動間充質細胞轉化的過程，首次于雞胚胎發育過程中提出[37]。在某些類型的癌細胞中，上皮細胞向間充質細胞的表行轉化過程可能在轉移和侵襲性中起決定性作用[38-39]。細胞在發生EMT形態變化時，將極化上皮表型轉化為成纖維細胞樣間充質表型。在自然條件下，上皮細胞以擁擠的細胞簇形式存在，保持細胞與細胞的接觸。相反，間充質細胞控制松散，遷移傾向增強。最后，這個過程導致癌癥轉移更快，更具侵襲性[40-41]。已有的研究已經證明了上皮-間質轉化在腫瘤缺氧中的重要作用[42]。值得注意的是，低氧條件下胰腺癌細胞EMT過程的特點是N-cadherin、Vimentin、Snail和Twist過表達，E-cadherin抑制[43]。在胰腺腫瘤中，EMT在入侵和代謝過程中起著重要的作用。低氧微環境中HIF-1過表達可促進細胞EMT的表達，引起腫瘤的遷移和侵襲。

低氧條件下腫瘤細胞衍生的非編碼RNA在促進血管生成和傳播方面也發揮了重要作用。缺氧可激活HIF-1α并誘導自噬，抑制自噬可減輕腫瘤轉移。在結直腸癌細胞中，lncRNA CPS1-IT通過滅活HIF-1α抑制由腫瘤組織缺氧條件下誘導的自噬作用，從而抑制結直腸癌的發展。在胰腺癌細胞中，有關實驗室研究證明，lncRNA NORAD在缺氧條件下呈高表達，并且通過促進細胞的上皮間質轉化促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。lncRNA NORAD與miR-125a-3p相互作用是胰腺癌發生發展的重要因素。此外，lncRNA NORAD的高表達與患者預后呈負相關，這也提示其可以作為臨床預后指標[44]。最近Deng等人[45]的研究證明缺氧誘導下的lncRNA-BX111通過調節ZEB1轉錄促進胰腺癌的轉移和進展，并且ZEB1又恰恰是EMT的關鍵調控因子?，F已經證實：胰腺癌中HIF-1通過誘導缺氧微環境刺激相關lncRNA的高表達，進而來影響腫瘤細胞的侵襲和轉移。

3 小結

近些年來，人們通過基因芯片技術發現惡性腫瘤中異常表達lncRNA，進而有目的研究其與胰腺癌的關系。結合相關研究不難發現，lncRNAs在胰腺癌的早期診斷和治療中有著巨大的潛力，深入研究其功能及其調控機制有助于尋找胰腺癌診斷和治療的新靶點。另外對于胰腺癌這類乏氧腫瘤，它自身可以通過各種機制來適應這種變化，比如腫瘤細胞內上調HIF-1的表達，增強糖酵解反應，細胞增殖因子表達增強，進一步誘導EMT產生等等。結合缺氧微環境和lncRNA的相關關系，從而探究它們促進胰腺癌進展的多種機制通路，將會成為腫瘤的預防及其治療一條新的道路。