DNA聚合酶ε的生物學(xué)功能研究進(jìn)展

張 馳,高世超 綜述,王培昌 審校

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京 100053)

真核細(xì)胞DNA聚合酶包括DNA聚合酶α、β、γ、δ、ε 5種，其在DNA復(fù)制及DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。DNA半保留復(fù)制是細(xì)胞有絲分裂的重要基礎(chǔ)，DNA合成率下降是細(xì)胞衰老的主要生理機(jī)制。基于氧化損傷等導(dǎo)致的DNA損傷可引起DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯異常，不僅與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，也與多種疾病的發(fā)生緊密關(guān)聯(lián)。DNA聚合酶ε不僅參與DNA合成復(fù)制，還在DNA損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用，對(duì)于維持基因組完整性和遺傳穩(wěn)定性有重要意義。自DNA聚合酶ε在1970年首次發(fā)現(xiàn)后，有很多研究者對(duì)其功能進(jìn)行了較為深入的研究，本文就DNA聚合酶ε的生物學(xué)功能最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 DNA聚合酶ε的早期研究

真核DNA聚合酶ε于1970年首次從酵母中分離獲得，其后許多研究者對(duì)其結(jié)構(gòu)、功能和機(jī)制進(jìn)行了研究。1995年NAVAS等[2]發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶ε與DNA復(fù)制中的S相位點(diǎn)有相關(guān)性。1996年SHCHERBAKOVA等[3]以酵母菌為模型證明DNA聚合酶ε和DNA聚合酶δ可以對(duì)DNA合成的錯(cuò)誤進(jìn)行修復(fù)。2006年RYTK?NEN等[4]對(duì)人類的DNA聚合酶α、DNA聚合酶δ和DNA聚合酶ε在S期過程中的作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在DNA復(fù)制早期，DNA聚合酶ε是最活躍的。2010年OGI等[5]研究發(fā)現(xiàn)約50%的DNA修復(fù)合成是由CTF18-RFC和DNA聚合酶ε作用的。

2 DNA聚合酶ε的組成及結(jié)構(gòu)

DNA聚合酶ε是DNA聚合酶B家族的成員之一，相對(duì)分子質(zhì)量約為371×103，含有Pol2、Dpb2、Dpb3和Dpb4共4個(gè)亞基[6]，分別由 POLE1、POLE2和POLE3基因編碼而成[7]。

Pol2是DNA聚合酶ε的催化亞基，相對(duì)分子質(zhì)量為(147～156)×103，編碼基因位于14號(hào)染色體，編碼序列為NC_000014.9，長(zhǎng)度為58 kbp。Pol2與其他B家族成員的催化亞基在結(jié)構(gòu)上有同源性，其N端結(jié)構(gòu)域與DNA聚合酶ε催化活性和外切酶活性密切相關(guān)，C端結(jié)構(gòu)域的功能尚不清楚，但C端結(jié)構(gòu)域中的鋅指結(jié)構(gòu)(CX2CX18CX2CX30CX2CX11CXC)與Dpb2的相互作用卻是細(xì)胞存活所必須的[7]。

Dpb2是聚合酶ε的第2大亞基，相對(duì)分子質(zhì)量為(59～86)×103，由3個(gè)部分組成，編碼基因位于14號(hào)染色體，編碼序列為NC_001148.4，長(zhǎng)度為2.7 kbp。雖然Dpb2是非催化亞基，但其對(duì)細(xì)胞的存活至關(guān)重要[8]。所有包含保守性Dpb2結(jié)構(gòu)的DNA聚合酶都與DNA復(fù)制有關(guān)，Dpb2的缺失雖然不會(huì)降低DNA聚合酶ε的催化活性，但如果Dpb2功能障礙，將導(dǎo)致DNA復(fù)制延長(zhǎng)，延長(zhǎng)S期，增加自發(fā)突變的發(fā)生[9]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，Dpb2如發(fā)生突變，則不能激活nrm1調(diào)控的復(fù)制檢查點(diǎn)，造成細(xì)胞死亡[10-12]。

Dpb3和Dpb4是2個(gè)最小的亞基，Dpb3的編碼基因位于2號(hào)染色體，編碼序列為NC_001134.8，長(zhǎng)度為788 bp。Dpb4編碼基因位于4號(hào)染色體，編碼序列為NC_001136.10，長(zhǎng)度為769 bp。Dpb3 和Dpb4是非必需亞基，與CCA AT結(jié)合因子密切相關(guān)，其并沒有加強(qiáng)DNA聚合酶ε的催化活性，但是在正常的復(fù)制叉進(jìn)程中，與Dpb11和Rad53的基因作用時(shí)，因其可保證反應(yīng)的穩(wěn)定性，所以又是必不可少的。并且它們?cè)贒NA復(fù)制過程中起到調(diào)節(jié)異染色質(zhì)重組，確保染色質(zhì)中表觀遺傳標(biāo)記遺傳的作用。

3 DNA聚合酶ε的相關(guān)蛋白

Dpb11是DNA復(fù)制和S期檢查點(diǎn)所必須的[13]。在DNA復(fù)制起始時(shí)，Dpb11與DNA聚合酶ε結(jié)合形成CMG復(fù)合物，對(duì)復(fù)制叉的形成起重要作用[14]。TopBP1是Dpb11的人類同源體，Topbp1在人類細(xì)胞中缺乏并不會(huì)使細(xì)胞死亡，但是會(huì)使細(xì)胞由于S期中DNA鏈斷裂而導(dǎo)致基因復(fù)制不穩(wěn)定。

Mdm2是一種腫瘤相關(guān)蛋白，在許多人類腫瘤中水平升高，是p53的一個(gè)主要負(fù)調(diào)節(jié)因子，作為E3泛素連接酶，以p53為降解靶點(diǎn)。Mdm2的N-端166氨基酸區(qū)域與DNA聚合酶ε的C端結(jié)構(gòu)域相互作用以刺激DNA聚合酶ε的活性，以此調(diào)節(jié)DNA聚合酶ε對(duì)DNA的校對(duì)及修復(fù)[6]。

Tim-tipin 復(fù)合體在S期檢查點(diǎn)和復(fù)制叉穩(wěn)定性中發(fā)揮了重要作用，但其生物功能的分子機(jī)制尚不完全清楚。最新的研究發(fā)現(xiàn)重組人Tim-Tipin復(fù)合物能夠顯著增強(qiáng)DNA聚合酶ε的合成活性[15]。

Mrc1是一種復(fù)制叉相關(guān)蛋白，在DNA復(fù)制和調(diào)節(jié)S期檢查點(diǎn)的過程中都起到重要作用。DNA聚合酶ε通過Pol2的N端具有催化功能的結(jié)構(gòu)域結(jié)合Mrc1的N端，并通過Pol2的C端結(jié)合Mrc1的C端。Mrc1與 Mcm6和DNA聚合酶ε相互作用，可以穩(wěn)定解旋酶和DNA聚合酶ε之間的相互作用[16]。

4 DNA聚合酶ε的生物學(xué)功能

DNA聚合酶ε在復(fù)制DNA前導(dǎo)鏈和延遲鏈方面發(fā)揮重要作用，并且其在清除引導(dǎo)鏈中的DNA聚合酶δ產(chǎn)生的錯(cuò)誤方面發(fā)揮重要作用。此外，DNA聚合酶ε還參與DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期進(jìn)程的控制、染色質(zhì)重塑和遺傳調(diào)控，以確保信息穩(wěn)定地從母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到子細(xì)胞[17-20]。

4.1DNA聚合酶ε在DNA復(fù)制中的作用 細(xì)胞DNA復(fù)制機(jī)制是高度保守的，所有的生物體都以類似的方式進(jìn)行半保留復(fù)制。DNA聚合酶ε在穩(wěn)定的復(fù)制叉上進(jìn)行主鏈DNA合成[21]。在S期復(fù)制開始時(shí)，通過包括Cdc45、Sld2、Sld3和Dpb11等多個(gè)蛋白的結(jié)合和磷酸化，形成CMG(Cdc45-MCM-GINS)復(fù)合物[22]，建立復(fù)制叉，在激活后，通過與CTF18-RFC結(jié)合，將PCNA加載到復(fù)制模板的3’端，作為DNA 合成的一個(gè)平臺(tái)，用于DNA聚合酶的加載及岡琦片段的加工、DNA損傷修復(fù)、染色質(zhì)組裝和染色單體黏附。但在PCNA缺失的情況下，DNA聚合酶ε仍然能夠獨(dú)立合成DNA[23-24]。

4.2DNA聚合酶ε在DNA損傷修復(fù)中的作用 許多形式的內(nèi)源性DNA損傷是自發(fā)產(chǎn)生的，在某些情況下是高頻率發(fā)生的[25]。DNA聚合酶ε最初被認(rèn)為能夠修復(fù)人類細(xì)胞修復(fù)缺陷的可溶性因子，其與DNA聚合酶δ兩者均能夠支持核苷酸切除修復(fù)重組，因?yàn)閮烧叩耐蛔凅w均顯示NER活性降低。直到2010年才發(fā)現(xiàn)約50%的修復(fù)合成是由DNA聚合酶ε與CTF18-RFC協(xié)同完成的，剩下50%是DNA聚合酶δ、κ與CTF18-RFC協(xié)同完成的,但具體的過程尚未明確。

4.3DNA聚合酶ε的其他功能 人類的DNA聚合酶ε是 RNA PolⅡ增加轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體的一部分，它增加了轉(zhuǎn)錄激活。這個(gè)復(fù)合體包含許多修復(fù)因素。進(jìn)一步的研究表明DNA聚合酶ε與RNA polⅡ的過度磷酸化有關(guān)，在轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)生，與RNA轉(zhuǎn)錄過程中的DNA損傷修復(fù)有關(guān)[26]。

5 DNA聚合酶ε與疾病的關(guān)系

5.1阿爾茨海默病 阿爾茨海默病是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。臨床上以記憶障礙、失語、失用、失認(rèn)、視空間技能損害、執(zhí)行功能障礙及人格和行為改變等全面性癡呆表現(xiàn)為特征。近期的全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，19個(gè)基因區(qū)域的突變似乎與患病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān),其中TREM2發(fā)生突變時(shí)，罹患阿爾茨海默病的風(fēng)險(xiǎn)高出2～3倍[27]。BUCHOLTZ等[28]的研究表明,包括DNA聚合酶ε在內(nèi)的多種蛋白，對(duì)相關(guān)DNA損傷可以進(jìn)行堿基切除修復(fù)，其水平和活性與阿爾茨海默病的多種相關(guān)蛋白表達(dá)有相關(guān)性。

5.2癌癥 盡管腫瘤的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，但其與相關(guān)基因突變存在密切關(guān)聯(lián)， DNA聚合酶ε在DNA合成及損傷修復(fù)中扮演關(guān)鍵角色，研究表明，精準(zhǔn)的復(fù)制能夠有效抑制腫瘤的發(fā)生[29-31]。當(dāng)DNA聚合酶ε的核酸外切酶區(qū)發(fā)生突變時(shí)，DNA復(fù)制過程中突變率將升高10～100倍，POLE發(fā)生種系突變和體細(xì)胞突變時(shí)，發(fā)生子宮內(nèi)膜癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌和膠質(zhì)瘤的概率大大提高[32]。在子宮腫瘤中DNA 聚合酶ε超突變與T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和對(duì)鉑類化療藥抗藥性增加有關(guān)[33]。2019年1月，PARKASH等[34]發(fā)現(xiàn)，最常見的復(fù)發(fā)性癌癥相關(guān)的DNA聚合酶ε突變是在核酸外切酶區(qū)域的P286R替換。

6 展 望

DNA聚合酶ε在DNA復(fù)制、細(xì)胞周期進(jìn)程的控制、損傷修復(fù)、染色質(zhì)重塑和遺傳調(diào)控中發(fā)揮重要的作用，同時(shí)其在腫瘤、衰老及衰老相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展中同樣具有十分重要的意義，然而其具體分子機(jī)制尚不十分清楚，尤其是對(duì)DNA聚合酶ε增齡過程中的變化機(jī)制研究甚少。因此，深入闡明DNA聚合酶ε在衰老過程中的變化及其機(jī)制，將為揭示腫瘤、衰老的發(fā)生奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，并為腫瘤預(yù)防、衰老及衰老相關(guān)疾病的干預(yù)提供重要靶點(diǎn)。