高職院校“雞新城疫抗體水平測定”技能大賽操作要點探索

張春霞

(青海畜牧獸醫職業技術學院，青海 湟源 812100)

本賽項由學校、行業、企業共同設立。通過采取全國統一標準進行技能競賽，有效促進全國高職院校畜牧獸醫類專業之間的交流，引領專業建設與課程改革；能進一步深化學校與企業之間的合作交流，為專業建設和課程改革增添了新的思路，同時通過本賽項的資源轉化，可以向社會展示畜牧獸醫類專業的師生風采和建設成果，提高專業的教學水平，提升人才培養質量[1,2]。

1 比賽對照標準

雞新城疫抗體水平測定技能大賽賽項是以教育部頒布的國家職業標準《動物疫病防治員》（高級）為基礎，以國家標準GB/T16550-2008[3]《雞新城疫診斷技術》為依據，嚴格按照大賽組委會賽項規定[4]，進行結果判定和評分。

1.1 實驗儀器的準備

以2018年全國職業院校技能大賽賽項規程為例。實驗器材的準備占實驗總成績的8%。主要要求參賽選手按照操作規程進行器材準備，要求器材選擇正確、擺放有序，物品標識合理，桌面整潔等。由賽組委會提供的項目競賽用儀器、設備與材料共計34項。但在實際操作過程中并不是所有的全部選用，選擇儀器設備要以“使用合理的前提下夠用”為原則。在儀器與材料準備時要檢查清點，并要做好清晰合理的標識。使用的燒杯、離心管、離心管蓋和血凝板都要進行標識。實驗器材的擺放要嚴格遵守分區擺放的原則，明確污染區和潔凈區各自物品的數量和用途。擺放完畢盡可能的不要去來回挪動器材，盡可能的做好各區域之間的互不干擾。該賽項中主要用到的儀器有不同規格的精準微量移液器及相應的配套材料、離心機、托盤天平、微型震蕩器，用到的實驗材料及動物有非免疫公雞、禽用采血器、96孔微型反應板、燒杯等。對儀器的操作和使用要掌握其工作的原理，尤其要做好規范操作和合理使用。

1.2 1%雞紅細胞懸液配制

1%雞紅細胞懸液的配置情況直接影響到實驗的進度和實驗結果的準確性。而配置過程中采血是否成功是最為關鍵的。在配置1%雞紅細胞懸液時，首先采血前要做好相關準備工作，采血器的正確選擇、雞的正確保定、3.8%枸櫞酸鈉的量、采血時的手法、采血的量、采血部位的處理以及后期對使用器材的正確處理等都要嚴格按照相關規定。其次，要控制好倍比稀釋液（生理鹽水）的量，以及添加稀釋液后的配平，第一次離心時轉速和時間的選則、離心完成后是否完全吸取白細胞層和血小板層。最后，在離心管中紅細胞吸取的位置、吸取的量，以及吸取后洗滌的次數等都按照參賽規程的評分標準進行操作。對參賽規定和國標要求不夠明確的，多次的進行嘗試性試驗，并每次對比各種操作方法的實驗結果選取最佳的操作方法，保證各項操作盡可能規范，提高配置的紅細胞濃度的準確性。

1.3 血凝（HA）實驗

取血凝反應板，先對其進行標注，尤其標明該反應板為血凝實驗操作用，標明第10、11、12孔位置，以防加樣時混淆。加樣時要確保液體完全加入到v型板的底部，不能加到壁上甚至是濺出到孔外，加樣過程中應盡可能的懸空加樣，不能出現碰壁的情況，倍比稀釋時要確保每一孔的吹吸次數是一樣的，加紅細胞時一定要邊搖邊加，盡量保證每一孔當中加入的紅細胞的濃度是一樣的，加樣時應該從后往前加，減少相鄰孔之間的交叉污染。抗原懸液的滴加也要從后往前加，加入前也要混勻，減少實驗誤差。反應板震蕩的時間、感作時間和室溫的要求嚴格按照國家標準。結果判定時在生理鹽水對照孔呈現明顯的紐扣狀沉到孔底時判定實驗結果。

1.4 配制四單位病毒

四單位病毒（4HAU）的配置要根據血凝實驗的結果和待檢血清的份數來進行計算。4HAU的配備是否準確會直接影響實驗結果的準確性。在平時準備或訓練階段一定要做回滴實驗[5]來進行校正配置的4HAU濃度是否準確。生理鹽水和抗原的總配置量按照評分標準不能超過10～20 ml。稀釋的倍數要反復計算正確，在加入抗原時一定要反復吹洗多次。

1.5 血凝抑制（HI）實驗

首先要對反應板進行標記，每個反應板的第10、11和12孔、陰陽性對照組、待檢血清都要進行仔細的標記。加入的待檢血清的編號一定要跟反應板標記的編號一一對應。每個待檢血清加入前都要充分搖勻，加入四單位抗原和紅細胞懸液時也要充分混勻，要從后往前邊搖邊懸空加樣，保證每一孔加進去的液體的濃度和數量是一致的。在倍比稀釋的過程當中不但要保證每孔吹吸的次數是一樣的還要保證倍比稀釋不產生氣泡。操作時間和結果的判定同樣要嚴格依據國家標準GB/T16550-2008[1]《雞新城疫診斷技術》的要求，在生理鹽水對照孔和陰陽性對照成立的前提下進行結果的判定。

1.6 抗體滴度報告

報告單主要填寫血凝實驗的血凝價，4單位抗原的稀釋度和每個待檢血清的血凝抑制價等。實驗結果出來后要馬上舉手示意評委。在填寫抗體的滴度時一定要用log2來進行規范表示。記錄要填寫清楚，不亂涂亂改。實驗結束后儀器和器皿要復位，采血器、殘留的紅細胞泥離心管等都要放入到固廢缸，要保證實驗場地的整潔。

2 結果判定是比賽關鍵點

結果判定和抗體滴度報告占34分，抗體滴度結果的判定一定是在標準陽性血清和標準陰性血清對照成立的前提下，在對照孔紅細胞呈明顯鈕扣狀沉淀到孔底時判定結果，以能完全抑制紅細胞凝集的血清的最大稀釋度作為該血清的血凝抑制價。整個實驗過程中結果的讀取都一定要遵循“完全”的原則。