幾種生防細菌對尖孢鐮刀菌的抑菌效果及其相互間包容性生長的快速檢測①

孫茜茜 李春強 易小平

(中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所/農業農村部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室 海南海口571101)

茄子枯萎病和香蕉枯萎病都是由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）侵染引起的真菌性病害。茄子枯萎病是茄科蔬菜的主要病害，近年來有加重趨勢。香蕉枯萎病是目前香蕉最嚴重的病害，制約著香蕉產業的可持續發展。枯萎病的防治方法雖有多種，抗病品種選育是關鍵，但進程緩慢，作物也會隨著病原菌的致病性變異而重新染病；化學防治簡單快速，卻易造成環境污染，病原菌易產生抗藥性等副作用；目前生物防治安全、高效，越來越受到人們的關注［1]，是值得推廣的防治方法。微生物菌劑的應用是生物防治的重要方面，通過生防菌的生命活動，使土壤酶活性增強，難溶性礦物養分被分解，或通過分泌植物激素［2]，增加植物養分的供應量和促進植物生長［3]，或改變根際菌群主導微生物群落，從而減少病原體在植物根際的定殖等［4]。生防菌篩選一直是病害防治的重要方面，微生物菌劑具有良好的應用前景。

芽孢桿菌（Bacillus）是一類好氧或兼性厭氧的能形成抗逆性芽孢（內生孢子）的桿菌，具有種類多、繁殖快、抗逆性強等特點，芽孢桿菌屬的各類有益菌株在工業、農業及醫學等科學領域有著廣泛的應用價值。目前應用廣泛的芽孢桿菌各有不同的功效，如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）會產生多肽類活性物質和生物表面活性素，對致病菌有明顯抑制作用；膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus） 主要用于固氮、解磷、解鉀，增進土壤肥力，提高營養元素；地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）對灰霉病菌和炭疽病菌有抑制作用［5]；巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）作為溶磷菌，可以提高作物產量；解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amylo‐liquefaciens）具有促生、防病及定殖能力。本實驗室先前分離篩選了8 種生防菌，分別是JK01菌、JK02 菌、JK2015 菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌，現針對茄子枯萎病菌（Fusarium oxysporumf. sp.melongenae）和香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporumf. sp.cubense）兩種病原真菌拮抗菌株進行初步篩選，以期尋找合適的微生物菌劑可以有效防治茄子枯萎病菌和香蕉枯萎病菌。結合生防菌的不同特性，并測定菌株間是否能夠包容生長，為進一步開發混合微生物肥料奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：茄子枯萎病菌尖孢鐮刀菌茄子專化型（Fusarium oxysporumf. sp. melongenae，Fom）由福建農科院肖榮鳳老師惠贈；香蕉枯萎病菌尖孢鐮刀菌古巴專化型4 號小種（Fusarium oxysporumf.sp.cubenserace 4，Foc4）本室分離保存；生防菌為JK01 菌、JK02 菌、JK2015 菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌，均由本室分離保存。供試培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）、LB固體培養基。

1.2 方法

抑菌試驗：采用平板對峙法進行8種生防菌對茄子枯萎病菌和香蕉枯萎病菌的抑菌活性測定。分別將茄子枯萎病菌和香蕉枯萎病菌菌餅接種于PDA 固體平板中央，在距離菌餅2.5 cm 處接種細菌菌株，3 次重復試驗，以不接種生防菌的病原菌作為對照，在28℃恒溫培養箱中培養。接種5 d 后，采用十字交叉法測量各處理菌落直徑（即：每個菌落橫著測一次豎著測一次求平均值，目的是減小誤差，因為菌落并非都是正圓形的；如果遇到有的橢圓型菌落橫豎測量值相差大于1 cm，將舍棄此數據，以其它重復計算）。抑制率計算參照文獻［6]進行，具體計算公式為：抑制率＝［對照菌落擴展直徑（mm）－處理組菌落擴展直徑（mm）]/對照菌落擴展直徑（mm）×100%，其中：菌落擴展直徑（mm）＝菌落測量直徑（mm）－菌餅直徑（mm）。采用SPSS 軟件進行數據統計分析，利用Duncan 氏新復極差法進行差異顯著性分析。包容性生長測試：用接種環分別對8 種生防菌進行LB 固體平板劃線，在28℃恒溫培養箱中培養3 d 后，挑取單菌落，并接種于LB 液體培養基中進行搖菌活化。將已活化的8 種生防菌菌液，采用三三組合方式在LB 固體平板上劃線，劃線的3種細菌盡量靠近但不貼在一起，3 個重復；然后28℃培養2 d 后，觀察彼此之間是否能生長在一起。若彼此之間能夠融合生長，或菌斑邊緣界限雖然清楚但能夠重疊生長在一起（可能是一種共處關系），則認為彼此之間能夠包容生長，標記為“＋”；若彼此之間有明顯的抑制，即菌斑邊緣界限較大或不能生長在一起，而且有明顯的排它性，則認為彼此之間不包容生長，標記為“－”。

2 結果與分析

2.1 8種生防菌的抑菌效果

2.1.1 生防菌對茄子枯萎病菌的抑菌效果

8 種生防菌對茄子枯萎病菌的抑菌效果見圖1。

圖1 8種生防菌對茄子枯萎病菌的抑制效果

從圖1可以看出，巨大芽孢桿菌對茄子枯萎病菌生長無明顯抑制作用，抑菌率只有6.1%。地衣芽孢桿菌對茄子枯萎病菌和也無明顯抑菌作用，抑菌率只有3.48%。其余6 種生防菌對茄子枯萎病菌都有抑菌效果，抑菌率為28.99%～52.54%，抑菌效果JK2015 菌＞膠凍樣芽孢桿菌＞JK02 菌＞JK01 菌＞枯草芽孢桿菌＞解淀粉芽孢桿菌（見表1）；其中JK2015菌的抑菌活性（抑菌率為52.54%）顯著高于膠凍樣芽孢桿菌（抑菌率為48.48%），膠凍樣芽孢桿菌抑菌活性顯著高于JK01 菌（抑菌率為43.24%），JK01 菌和JK02 菌（抑菌率為46.11%）抑菌活性顯著高于枯草芽孢桿菌（抑菌率為34.42%）；枯草芽孢桿菌顯著高于解淀粉芽孢桿菌（抑菌率為28.99%）。

2.1.2 生防菌對香蕉枯萎病菌的抑菌效果

8 種生防菌對香蕉枯萎病菌的抑菌效果見圖2。

圖2 8種生防菌對香蕉枯萎病菌的抑制效果

從圖2可以看出，巨大芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌對香蕉枯萎病菌Foc4 均無明顯抑菌作用，抑菌率分別只有6.3%和7.25%；其余6 種生防菌對Foc4都有一定的抑菌效果，抑菌率為54.92%～70.45%不等，抑菌效果JK2015 菌＞膠凍樣芽孢桿菌＞JK02 菌＞JK01 菌＞枯草芽孢桿菌＞解淀粉芽孢桿菌（表1）。其中JK2015 菌的抑菌活性和膠凍樣芽孢桿菌差異不顯著，JK02 菌的抑菌活性和JK01 菌差異不顯著，但是前兩者抑菌活性都顯著高于后兩者，JK2105、膠凍樣芽孢桿菌、JK02 菌和JK01菌抑菌率分別為70.45%、69.29%、66.35% 和65.92%；JK01 菌和JK02 菌的抑菌活性顯著高于枯草芽孢桿菌菌（抑菌率為61.10%）；枯草芽孢桿菌顯著高于解淀粉芽孢桿菌（抑菌率為54.92%）。

表1 8種生防菌對茄子枯萎病菌和香蕉枯萎病菌的抑菌率測定結果 單位：%

2.2 8種生防菌包容性生長試驗

對JK01 菌、JK02 菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、JK2015菌8種生防菌相互間是否能夠包容生長進行了測定，結果見圖3、4。結果表明，JK01 菌不能與枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌包容生長；JK02 菌不能與枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌包容生長；枯草芽孢桿菌不能與JK01 菌、JK02 菌、膠凍樣芽孢桿菌包容生長；而其余菌株之間均可以包容生長。其中，巨大芽孢桿菌與其它菌株均可以包容生長；地衣芽孢桿菌與其它菌株均可以包容生長；JK2015 菌與其它菌株均可以包容生長；膠凍樣芽孢桿菌除不能與枯草芽孢桿菌包容外，與其它菌株均可以包容生長。

3 討論與結論

我國農業長期過度依賴化肥，土壤生態質量遭到嚴重破壞，采用生物防治的方法防治植物病害已成為大趨勢。選用多種能夠包容性生長的生防菌，配成混合菌劑并結合田間試驗以獲得廣譜高效的、易于培養的微生物菌劑或微生物肥料，對于植物病害的防治具有重要意義。為了減少化肥和化學農藥使用，近年來復合微生物菌劑在農業生產中越來越發揮著重要作用。葉乃瑋等［7]發現，組合木霉菌可濕性粉劑比單一木霉菌更能顯著降低香蕉枯萎病的病情，同時還利于提高香蕉產量。研究發現在常規施肥基礎上施用復合微生物菌劑對作物花椰菜、茶葉、葡萄、翠冠梨都有較好增產增收效果［8]。采用復合微生物菌劑與氨基酸水溶肥組合能有效抑制根結線蟲的增長和根結的形成，抑制率高于90%［9]。但是，了解各微生物之間能否包容生長對其在農業生產上的應用十分重要。

圖3 8種生防菌間的包容性生長統計結果

為了解生防菌之間的生長是否相互影響，采用平板劃線共培養，開發出一種快速檢測方法，對8種生防菌之間的包容性做出快速初篩，結果發現：JK01 和JK02 不能與枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌包容生長，枯草芽孢桿菌不能與膠凍樣芽孢桿菌包容生長，其余菌株間都可以包容生長。微生物包容生長機制比較復雜，但一般認為，微生物之間的生長不受對方影響就認為包容，當然有的還能互相促進，如由巨大芽孢桿菌和氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacterium oxydans）等伴生菌的維生素C發酵中，后者難以單獨培養，而前者可以為后者提供生產因子和生物活性物質協助后者合成維生素C 前體2-酮基-L-古龍酸［10]。本研究中各生防菌間的關系及包容性只是初步結果，其作用機制有待進一步深入探究。

圖4 8種生防菌間的包容性生長測試

同時，為明確幾種生防菌對茄子枯萎病菌和香蕉枯萎病菌的抑菌效果，采用平板對峙法進行抑菌譜試驗。結果表明，JK2015 菌對茄子枯萎病菌和香蕉枯萎病菌的抑菌效果最為明顯，而巨大芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌對兩種病原真菌均無明顯的抑菌效果；對兩種病原菌的抑菌效果為：JK2015 菌＞膠凍樣芽孢桿菌＞JK02 菌＞JK01 菌＞枯草芽孢桿菌＞解淀粉芽孢桿菌。

上述結果，為微生物混合菌劑及茄子和香蕉專用生物肥料的開發奠定基礎。