黃芪甲苷抑制粘著斑激酶磷酸化改善高糖環(huán)境下的足細(xì)胞黏附能力的研究

何東元 鄭志貴 陳宜方 陳建國(guó)

糖尿病腎病是終末期腎病患者的首要病因，而足細(xì)胞損傷是糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。既往研究顯示，糖尿病患者早期就可出現(xiàn)足細(xì)胞黏附功能下降，足細(xì)胞脫落，導(dǎo)致腎小球基底膜裸露，加速糖尿病腎病進(jìn)展[2]。粘著斑激酶（FAK）在細(xì)胞黏附和遷移中發(fā)揮重要作用，若缺乏FAK，細(xì)胞遷移能力會(huì)出現(xiàn)顯著降低，且FAK磷酸化可改變細(xì)胞的黏附能力[3]。有不少研究顯示，傳統(tǒng)中藥黃芪的重要活性成分黃芪甲苷（AS-IV）對(duì)足細(xì)胞具有保護(hù)作用[4-6]，但作用機(jī)制尚未完全闡明。基于此，本研究旨在觀察AS-IV對(duì)高糖環(huán)境下足細(xì)胞黏附能力的影響，并探討其作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 條件永生化小鼠足細(xì)胞（浙江醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室）；AS-IV 單體（TLC純度 98%）、D-葡萄糖和 γ-IFN（美國(guó)Sigma公司）；FBS、青霉素、鏈霉素和RPMI 1640培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco公司）；抗FAK抗體、抗磷酸化FAK（p-FAK）抗體、抗GAPDH抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗和ECL化學(xué)發(fā)光劑（美國(guó)Santa Cruz公司）；RAPA蛋白裂解緩沖液（中國(guó)上海聯(lián)碩生物科技有限公司）；BCA試劑盒（美國(guó)Pierce公司）；Transwell-Col PTFE過(guò)濾器（3μm孔，美國(guó)Corning公司）；細(xì)胞黏附熒光定量試劑盒（美國(guó)Calbiochem公司）；Bio-Rad 2000凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；FlexStation 3熒光讀板儀（美國(guó)Molecular Devices公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 條件永生化小鼠足細(xì)胞生長(zhǎng)在RPMI 1640培養(yǎng)液（含10%FBS、100U/ml青霉素和100mg/L鏈霉素）中。在33℃、10U/ml γ-IFN條件下傳代，在37℃、無(wú)γ-IFN條件下誘導(dǎo)分化。分化后的足細(xì)胞用1%FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)24h同步化后分為以下4組。正常對(duì)照組（Con組）：D-葡萄糖 5mmol/L；高糖組（HG組）：D-葡萄糖30mmol/L；高糖+低劑量AS-IV組（HG+LD 組）：D-葡萄糖 30mmol/L+AS-IV 50mg/L；高糖+高劑量AS-IV組（HG+HD組）：D-葡萄糖30mmol/L+ASIV 100mg/L。

1.2.2 足細(xì)胞黏附能力測(cè)定 使用細(xì)胞黏附熒光定量試劑盒檢測(cè)足細(xì)胞黏附能力。分化的足細(xì)胞種植在分別鋪有基底膜復(fù)合物（BMC）、小牛血清白蛋白（陰性對(duì)照）和多聚賴氨酸（陽(yáng)性對(duì)照）的96孔培養(yǎng)板中，按上述分組進(jìn)行干預(yù)。各組于干預(yù)3、6、12和24h后分別隨機(jī)選取24孔棄去培養(yǎng)液，每孔200μl PBS沖洗2次除去未黏附的細(xì)胞，每孔加入100μl熒光Calcein-A M工作液，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1h，熒光讀板儀（FlexStation 384）上檢測(cè)每孔相對(duì)熒光強(qiáng)度（RFU），激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)520 nm。RFU值越大，說(shuō)明黏附的細(xì)胞數(shù)量越多，細(xì)胞黏附能力越強(qiáng)。

1.2.3 白蛋白流量率檢測(cè)法測(cè)定足細(xì)胞單層屏障功能（單層滲漏白蛋白濃度） 5×105個(gè)分化的足細(xì)胞接種于Ⅰ型膠原包被Transwell上室（3μm孔），不同條件下培養(yǎng)48h。丟棄培養(yǎng)液，用含1mmol/L CaCl2和1mmol/L MgCl2的PBS洗2次。然后，上室填充0.15ml的RPMI 1640，底腔填充1ml含40mg/ml小牛血清白蛋白的RPMI 1640培養(yǎng)液37℃孵育6h。BCA試劑盒檢測(cè)上室培養(yǎng)液白蛋白濃度。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)FAK與p-FAK表達(dá) 各組細(xì)胞干預(yù)24、48h后，蛋白裂解液裂解各組細(xì)胞，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，2%小牛血清白蛋白的TBST室溫封閉60min，加入抗FAK、抗p-FAK和抗GAPDH抗體4℃孵育24h，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育60min，ECL發(fā)光劑在X線片上曝光顯影。Bio-Rad 2000凝膠成像系統(tǒng)掃描光密度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，得出目的蛋白與GAPDH光密度比值作為目的蛋白表達(dá)水平。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察并比較（1）4組足細(xì)胞黏附能力；（2）4組足細(xì)胞單層屏障功能；（3）4組足細(xì)胞FAK與p-FAK表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SigmaStat 12.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以 表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組足細(xì)胞黏附能力比較 見(jiàn)圖1。

圖1 4組足細(xì)胞黏附能力比較

由圖1可見(jiàn)，干預(yù)12h后，4組足細(xì)胞黏附能力比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），干預(yù) 3、6、12、24h 后，Con、HG、HG+HD組足細(xì)胞黏附能力比較差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。即高糖環(huán)境會(huì)降低足細(xì)胞的黏附能力，而AS-IV可明顯增強(qiáng)高糖環(huán)境下足細(xì)胞的黏附能力，且該作用具有時(shí)間和劑量依賴性。

2.2 4組足細(xì)胞單層屏障功能比較 見(jiàn)圖2。

圖2 4組足細(xì)胞單層屏障功能比較

由圖2可見(jiàn)，4組足細(xì)胞單層屏障功能比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。即高糖環(huán)境會(huì)降低足細(xì)胞單層屏障功能，而AS-IV可劑量依賴性地增強(qiáng)高糖環(huán)境下足細(xì)胞單層屏障功能。

2.3 4組足細(xì)胞FAK與p-FAK表達(dá)情況比較 見(jiàn)圖3。

圖3 4組足細(xì)胞FAK與p-FAK表達(dá)情況比較

由圖3可見(jiàn)，干預(yù)24、48h后，4組足細(xì)胞FAK表達(dá)情況比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），p-FAK表達(dá)情況比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）。即高糖環(huán)境對(duì)足細(xì)胞FAK表達(dá)無(wú)明顯影響，但會(huì)明顯增加FAK磷酸化；AS-IV可明顯抑制高糖環(huán)境下足細(xì)胞FAK蛋白磷酸化，且該作用具有時(shí)間和劑量依賴性。

3 討論

祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為黃芪具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、益衛(wèi)固表、利水消腫等功效。黃芪用于治療糖尿病和腎臟疾病已有上千年的歷史[4]。AS-IV是黃芪主要活性成分，具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎癥因子、抗間質(zhì)纖維化、抗凋亡和抗氧化應(yīng)激等多方面藥理作用。AS-IV被2005版《中國(guó)藥典》納作評(píng)估黃芪藥材質(zhì)量的指標(biāo)。既往研究顯示，AS-IV可通過(guò)抑制PERK-ATF4-CHOP信號(hào)通路抑制高糖環(huán)境下足細(xì)胞凋亡[5]，抑制NF-κB改善糖尿病大鼠足細(xì)胞足突融合，降低蛋白尿[6]，但AS-IV對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制尚未完全闡明。足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過(guò)屏障的重要組成部分，足細(xì)胞數(shù)量減少和/或功能障礙與蛋白尿的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7]。高糖環(huán)境下足細(xì)胞黏附能力減弱是足細(xì)胞從腎小球基底膜脫落的重要原因，也是早期糖尿病腎病進(jìn)展的重要原因[1]。足細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，幾乎沒(méi)有增殖能力[7]。足細(xì)胞脫落或壞死將導(dǎo)致足細(xì)胞數(shù)量不可逆性減少，基底膜裸露，腎小球壁層上皮細(xì)胞和裸露的基底膜粘連，最終導(dǎo)致腎小球硬化和腎臟功能衰竭[8]。研究顯示，1型糖尿病和2型糖尿病早期均有足細(xì)胞脫落和數(shù)量減少現(xiàn)象[9]。減少足細(xì)胞脫落可能成為未來(lái)糖尿病腎病治療的靶點(diǎn)。本研究采用細(xì)胞黏附熒光定量試劑盒檢測(cè)足細(xì)胞和BMC之間的黏附能力，采用白蛋白流量率檢測(cè)法檢測(cè)足細(xì)胞單層屏障功能。結(jié)果顯示，高糖環(huán)境下足細(xì)胞與BMC之間的黏附能力明顯下降，足細(xì)胞單層屏障功能明顯下降，而AS-IV干預(yù)可增強(qiáng)高糖環(huán)境下足細(xì)胞黏附能力，增強(qiáng)足細(xì)胞單層屏障功能，其作用具有時(shí)間和劑量依賴性。

FAK是一種非受體絡(luò)氨酸激酶，在細(xì)胞黏附中起重要作用。目前認(rèn)為FAK和β整合素直接相連，是整合素信號(hào)傳導(dǎo)的中樞介質(zhì)，也是其他細(xì)胞表面受體信號(hào)傳遞的重要組成部分[10]。FAK磷酸化是整合素、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白啟動(dòng)的信號(hào)通路中的早期事件，F(xiàn)AK調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移在許多類(lèi)型細(xì)胞中已被證實(shí)。表皮傷口愈合過(guò)程中遷移的角質(zhì)形成細(xì)胞FAK表達(dá)或激活增加，在體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移過(guò)程中也觀察到相同現(xiàn)象[11-12]。FAK在腎臟發(fā)育和細(xì)胞分化中起重要作用。FAK基因敲除的小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的中胚層缺陷，在胚胎早期死亡[13]。FAK沉默的成纖維細(xì)胞遷移能力嚴(yán)重缺陷[14]。抑制FAK磷酸化可導(dǎo)致成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力下降，過(guò)度表達(dá)FAK可導(dǎo)致多種細(xì)胞遷移能力增加[15]。既往研究顯示，足細(xì)胞表達(dá)FAK，足細(xì)胞損傷后FAK磷酸化增加。FAK磷酸化后可以激活多個(gè)下游信號(hào)通路，其中FAK/p38 MAPK通路是重要的一條。p38 MAPK屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，在炎癥、氧化應(yīng)激、衰老、自噬以及細(xì)胞凋亡中均有重要作用[16]。FAK/p38 MAPK通路參與阿霉素[17]和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷[18]。足細(xì)胞特異性敲除FAK基因或藥物抑制FAK/p38 MAPK信號(hào)通路可緩解蛋白尿和足細(xì)胞足突融合[17，19]。本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果相符，高糖環(huán)境對(duì)足細(xì)胞FAK表達(dá)無(wú)明顯影響，但會(huì)明顯增加FAK磷酸化；AS-IV可明顯抑制高糖環(huán)境下足細(xì)胞FAK蛋白磷酸化，且該作用具有時(shí)間和劑量依賴性。

綜上所述，AS-IV可能通過(guò)抑制FAK磷酸化改善高糖環(huán)境下足細(xì)胞的黏附能力。本研究結(jié)果或?qū)樘悄虿∧I病的早期治療提供理論參考。