SU5416在小鼠急性肺損傷中的作用及其機制研究

黃旭晴 蔣育悅 徐長青 郁東偉 王燕

急性肺損傷（ALI）常由實質性肺部感染或肺部出血引發，是以肺泡毛細血管膜受損為特征的異質性疾病，臨床主要表現為進行性呼吸困難和頑固性低氧血癥[1]。全身性損傷如創傷、敗血癥和急性腎損傷等也會引發ALI[2-3]。ALI的主要病理特征為肺內失控性炎癥反應，如大量中性粒細胞浸潤、肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷，彌漫性肺間質及肺泡水腫?？刮⑸镏委熀椭С种委煹葘LI有一定的效果，但ALI病死率仍高達30%～40%[4]，因此，研發ALI其他有效的治療藥物意義重大。ALI早期，在肺部出現明顯纖維組織增生的同時存在肺部微血管增多[5]，大多數組織的損傷修復都伴隨著微血管的改變?；诖?，本研究旨在探討血管內皮生長因子受體抑制劑Z-3-[（2,4-二甲基吡咯-5-烴基）亞甲基]-2-吲哚滿酮（SU5416）在小鼠ALI中的作用及其可能的作用機制，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 30只SPF級雄性C57BL/6小鼠（體重18～22g）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。脂多糖（LPS）購自美國Sigma公司。地塞米松購自百正藥業股份有限公司。SU5416購自美國Sigma公司。超氧化物歧化酶（SOD）、活性氧簇（ROS）檢測試劑盒和 IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒購自碧云天生物技術公司。人單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。B淋巴細胞瘤-2基因（bcl-2）、Toll樣受體 4（TLR4）、血管內皮生長因子（VEGF）、VEGF 受體 2（VEGFR2）、NF-κB、磷酸化 NF-κB（pNF-κB）購自安諾論公司。β-actin抗體購自武漢博士德公司。電泳儀電源、垂直電泳槽、電轉儀為北京六一儀器廠產品。正置光學顯微鏡為奧林巴斯公司產品。JEM-2100透射電子顯微鏡為日本電子公司產品。Abbott CD1700全自動動物血液細胞分析儀為邁瑞生物醫療電子股份有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠ALI模型制備與分組 將30只小鼠按隨機數字表法分為模型組、SU5416組、地塞米松組、SU5416+地塞米松組、空白對照組，各6只。小鼠以異氟醚麻醉。LPS用0.9%氯化鈉溶液溶解后，模型組、SU5416組、地塞米松組、SU5416+地塞米松組小鼠按5mg/kg的劑量滴鼻處理（均約0.5ml），空白對照組小鼠滴入等體積0.9%氯化鈉溶液。SU5416組小鼠在LPS處理1h后按20 mg/kg的劑量給予SU5416[以二甲基亞砜(DMSO）為溶媒]灌胃，地塞米松組小鼠按5mg/kg的劑量給予地塞米松（以DMSO為溶媒）灌胃，SU5416+地塞米松組小鼠按上述方法同時給予SU5416和地塞米松灌胃，空白對照組和模型組以等體積的含有DMSO的0.9%氯化鈉溶液灌胃。

1.2.2 支氣管肺泡灌洗液（BALF）中性粒細胞、淋巴細胞計數 各組小鼠灌胃干預24h后，使用40mg/kg劑量的戊巴比妥鈉麻醉；開胸，分離氣管，在氣管下穿一絲線，分離右主支氣管并用絲線結扎；于氣管環處剪一V型切口，插入直徑約2mm的無菌塑料管，絲線結扎固定，以4℃無菌0.9%氯化鈉注射液灌洗左肺（5ml×3次），反復抽吸3次，收集BALF于無菌瓶中。用Abbott CD1700全自動血細胞分析儀檢測各組小鼠BALF中性粒細胞和淋巴細胞數目。

1.2.3 肺組織SOD、ROS活性檢測 取各小鼠部分肺組織，4℃勻漿器進行勻漿，約12 000rpm，離心5min，提取上清液。參照SOD、ROS檢測試劑盒說明書方法進行檢測，并按照公式分別計算出SOD與ROS活性。

1.2.4 肺組織炎癥因子 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 水平檢測 采用ELISA法，取各小鼠部分肺組織，4℃勻漿器進行勻漿，約12 000rpm，離心5min，取上清液用于檢測 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 水平，操作參照ELISA試劑盒說明書進行。

1.2.5 bcl-2、TLR4、VEGF、NF-κB 蛋白水平檢測 采用Western blot法。取部分肺組織勻漿液，加5×蛋白上樣緩沖液后煮沸5min。制備10%SDS-PAGE膠，按40μg蛋白量上樣；120V電泳1.5h；350mA轉膜50min；5%脫脂奶粉溶液封閉 2h，按比例加入 bcl-2、TLR4、VEGF、VEGF2、NF-κB、pNF-κB 一抗后 4℃過夜；TBST 洗滌后加入二抗，作用2h；TBST洗膜后ECL顯像，以β-actin為內參，采用Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值。

1.2.6 肺組織病理形態觀察 取小鼠部分肺組織用10%甲醛固定、酒精脫水、石蠟包埋、連續切片、HE染色，光學顯微鏡200倍視野下觀察肺組織病理形態。另取小鼠部分肺組織，切成1mm3左右的組織塊，戊二醛溶液固定，經漂洗、固定、脫水、滲透、包埋、制片，用透射電子顯微鏡觀察肺組織超微結構的變化。

1.3 觀察指標 觀察并比較5組小鼠（1）BALF中性粒細胞、淋巴細胞計數；（2）肺組織 SOD、ROS 活性；（3）肺組織炎癥因子 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 水平；（4）肺組織 bcl-2、TLR4、VEGF、VEGFR2、NF-κB、pNF-κB 蛋白水平；（5）肺組織病理形態。

1.4 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件；計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 5組小鼠BALF中性粒細胞、淋巴細胞計數比較見表1。

表1 5組小鼠BALF中性粒細胞、淋巴細胞計數比較（×104個）

由表1可見，5組小鼠BALF中性粒細胞、淋巴細胞計數比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）；兩兩比較，除SU5416組與地塞米松組外，其余組間比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。即模型組小鼠BALF中性粒細胞、淋巴細胞明顯增多，說明小鼠ALI模型制備成功。SU5416與地塞米松均能抑制LPS刺激導致的ALI，兩者之間沒有明顯差異，但兩者聯用的抑制作用明顯強于其中一種單獨使用。

2.2 5組小鼠肺組織SOD、ROS活性比較 見表2。

表2 5組小鼠肺組織SOD、ROS活性比較

由表2可見，5組小鼠肺組織SOD、ROS活性比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）；兩兩比較，除SU5416組與地塞米松組小鼠肺組織SOD活性外，其余組間肺組織SOD、ROS活性比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。即模型組小鼠肺組織SOD活性明顯下降，ROS活性明顯上升；SU5416與地塞米松都能明顯逆轉這種改變，對SOD活性的改變，兩者沒有明顯差異，而地塞米松對ROS活性的改變更明顯，兩者聯用的逆轉改變明顯強于其中一種單獨使用。

2.3 5 組小鼠肺組織炎癥因子 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1水平比較 見表3。

表3 5組小鼠肺組織炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1水平比較（pg/mgprot）

由表3可見，5組小鼠肺組織炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1水平比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）；兩兩比較，除SU5416組與地塞米松組外，其余組間比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。模型組小鼠肺組織炎癥因子 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 水平均明顯上升，SU5416和地塞米松都能明顯逆轉這種改變，兩者之間沒有明顯差異，但兩者聯用的逆轉改變明顯強于其中一種單獨使用。

2.4 5 組小鼠肺組織 bcl-2、TLR4、VEGF、VEGFR2、NF-κB、pNF-κB蛋白水平比較 見圖1、表4。

由圖1、表4可見，5組小鼠肺組織bcl-2、TLR4、VEGF、NF-κB蛋白水平比較差異均有統計學差異（均P＜0.05）。即模型組小鼠肺組織在LPS刺激下抗凋亡蛋白 bcl-2 的表達下調，TLR4、VEGR、VEGFR2 和 pNF-κB的表達上調；SU5416與地塞米松均能明顯逆轉這些改變；與模型組比較，地塞米松組小鼠肺組織TLR4、VEGF的表達無統計學差異，而VEGFR2、pNF-κB表達明顯下調，抗凋亡蛋白bcl-2表達明顯上調。SU5416與地塞米松兩者聯用的逆轉改變明顯強于其中一種單獨使用。

圖 1 5 組小鼠肺組織 bcl-2、TLR4、VEGF、VEGFR2、NF-κB、pNF-κB蛋白電泳圖

2.5 5組小鼠肺組織病理形態比較 見圖2。

由圖2可見，光學顯微鏡下可見空白對照組小鼠肺泡結構正常，無充血，肺泡間隔正常，個別區域可見少量炎癥細胞浸潤；模型組小鼠可見明顯的肺泡炎癥表現，肺泡結構破壞，肺泡腔內可見水腫液，肺泡毛細血管充血、肺泡間隔厚度增加，并出現大量炎癥細胞浸潤；與模型組相比，SU5416組、地塞米松組小鼠肺泡間隔減小，炎癥細胞浸潤減輕，肺泡結構破壞減輕。SU5416+地塞米松組上述情況進一步減輕，接近正常。

電子顯微鏡下可見空白對照組小鼠肺泡上皮細胞形態和肺泡毛細血管膜結構基本正常。模型組小鼠肺泡上皮細胞細胞器減少，肺泡毛細血管內皮剝脫，肺泡壁嚴重破壞、壞死，肺泡間的間隔增寬，出現彌漫性的水腫，肺泡腔萎陷。與模型組相比，SU5416組、地塞米松組小鼠肺泡上皮細胞細胞器增多，肺泡毛細血管內皮少見剝脫，肺泡間的間隔縮小，水腫的肺泡萎陷程度減輕。SU5416+地塞米松組肺泡上皮細胞形態和肺泡毛細血管膜結構接近正常。

表 4 5 組小鼠肺組織 bcl-2、TLR4、VEGF、VEGFR2、NF-κB、pNF-κB 蛋白水平比較

圖2 5組小鼠肺組織病理形態比較（a：光學顯微鏡下所見，HE染色，×200；b：電子顯微鏡下所見，×10 000）

3 討論

本研究結果提示，LPS所致小鼠BALF中性粒細胞、淋巴細胞數目的改變，肺組織SOD、ROS活性，炎癥因子 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 水平，以及病理形態的改變說明小鼠ALI模型制備成功。地塞米松干預ALI在炎癥細胞沉積、炎癥介質釋放及肺水腫等方面均可發揮積極的作用。研究發現，低劑量地塞米松較高劑量更能改善肺炎癥介質的釋放[6]。因此本研究采用低劑量地塞米松干預作為陽性對照。

氧化應激由機體內氧化和抗氧化系統失衡導致，這兩大系統于機體內既相互制約又相互依存。ROS屬于氧化系統，而SOD屬于抗氧化系統。近年來，在ALI的機制研究中發現，氧化應激在ALI的病理發展過程中扮演重要角色[7]。抗氧化劑治療已經成為一些肺臟疾病的一種新方向，如N-乙酰半胱氨酸在臨床上表現出對ALI一定的治療效果[8-9]。本研究結果顯示，SU5416與地塞米松均能夠明顯抑制ROS活性，提高SOD的活性，減輕氧化應激，兩者聯合干預比單獨干預效果更好。

ALI是全身性炎癥之于肺部的具體表現，它的病理生理特點主要為中性粒細胞大量聚集導致炎癥持續存在[10]。ALI時肺泡巨噬細胞、中性粒細胞等炎癥細胞激活，同時釋放多種炎癥因子如 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1等，引起肺以及免疫系統的功能失調。中性粒細胞在炎癥的初始階段即參與其發生、發展，中性粒細胞的過度活化或持續存在會大量破壞基底膜，最終增強肺泡毛細血管通透性[11]。淋巴細胞在ALI的炎癥反應過程中也起著重要的調控作用[12]。TLR4是LPS受體，其作用是識別侵入體內的革蘭陰性細菌并啟動炎癥反應。TLR4激活將引起一系列下游分子的活化，并活化通用轉錄因子 NF-κB、AP-I等最終引起以 TNF-α、IL-1 等為中心的促炎癥因子激活，放大炎癥效應。本研究發現，SU5416與地塞米松均能夠減輕肺組織的炎癥反應，抑制 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 的表達，兩者聯用具有更好的效果。

血管活性物質和血管相關生長因子在ALI的發展中亦起重要作用[12-13]。VEGF是目前已知最強的血管滲透劑，在肺組織高表達，除此之外在肺泡Ⅱ型上皮細胞、間質細胞、活化的肺泡巨噬細胞和中性粒細胞中也都有表達。在病理情況下，肺泡上皮屏障被破壞，血管內皮細胞直接暴露于高濃度的VEGF，血管通透性增加，導致非心源性肺水腫[14]。VEGF作用機制就是與VEGFR結合，增加一氧化氮的釋放，刺激前列環素的產生，增加血管通透性[15]。且炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等均能誘導VEGF的表達，TLR4-NF-κB信號傳導通路也能夠介導VEGF的表達[16]。本研究結果顯示，SU5416能夠有效抑制VEGF和VEGFR的表達，此外SU5416能抑制TLR4表達，提高pNF-κB的表達。而地塞米松對于VEGF、TLR4沒有調控作用，說明地塞米松不是通過調控VEGF、TLR4途徑來發揮作用的。

細胞凋亡在ALI/急性呼吸窘迫綜合征（ALI/ARDS）發病中起至關重要的作用。在ALI/ARDS的發病中存在兩個重要的細胞凋亡相關機制。ROS又是細胞凋亡的重要媒介之一，可作為第二信使觸發凋亡信號途徑，如增加線粒體膜通透性轉換孔（mPTP）通透性，釋放CytC入細胞質，促凋亡因子釋放，最終導致細胞凋亡。因此不難想到，凋亡在ALI中會發揮重要作用[17]。本研究檢測了抗凋亡蛋白bcl-2的表達水平。SU5416和地塞米松均能上調bcl-2的表達，抑制凋亡。

綜上所述，SU5416對小鼠ALI具有保護作用，其作用機制可能是通過減輕炎癥反應、氧化應激以及調控TLR4/VEGF/NF-κB信號通路實現。