鼻腔定植耐甲氧西林金黃色葡萄球菌分離及其對消毒劑抗性研究

□李旺勝 于凡凡 肖 娜 唐一通

一、材料與方法

(一)菌株來源。試驗菌株為收集自108例健康在校大學生鼻拭紙樣本(男生65例，女生43例)，所有樣本均為來自不同個體的非重復性樣本。

(二)實驗材料。金黃色葡萄球菌顯色培養基(CHROMagarTM法國科瑪嘉)，哥倫比亞血瓊脂平板，營養肉湯培養基購自廣東環凱微生物科技有限公司,Ezup柱式細菌基因組DNA抽取試劑盒，即用Taq PCR擴增試劑盒，擴增引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司。試驗所用碘伏消毒劑(有效碘0.5%)和75%乙醇購自江西草珊瑚消毒用品有限公司。

(三)試驗方法。

1.菌株顯色培養與MRSA菌株鑒定。將收集鼻拭紙樣本接種至顯色培養基，37℃，恒溫培養48小時，挑取紅色或粉紅色菌落保存。并將挑選好的菌落接種至哥倫比亞血瓊脂平板，37℃，恒溫培養24小時。提取菌株基因組，進行SCCmecA基因PCR擴增，鑒定MRSA菌株。PCR引物為：forward:5’-TCCAGATTACAACTTCACCAGG-3’;Reverse:5’-CCACTTCATATCTTGTAACG-3’。擴增體系為：模板3μl;引物2μl;2×Master mix 10μl; ddH2O 5μl 擴增條件為：95℃ 4min；95℃ 45S，45℃ 45S，72℃ 60S；30循環,72℃ 5min。

2.菌懸液制備。分別取3株MRSA和MSSA菌株接種至營養肉湯培養基，37℃，恒溫培養24小時。721型紫外-可見分光光度計分別進行吸光度值(600nm)測定。用肉湯培養基將各菌株所在菌懸液吸光度值調整至0.5 OD備用。

3.MIC測定。肉湯稀釋法[1]，用滅菌蒸餾水對各消毒劑母液做系列對倍稀釋，取各稀釋度消毒液2.5ml加入到雙倍濃度營養肉湯試管中，分別接種0.1ml菌懸液作為試驗組。以同樣方法接種于不含消毒劑的營養肉湯中作陽性對照組；另取3支無菌試管加入滅菌蒸餾水與等量雙倍肉湯混合作陰性對照組。將各組接種試管，37℃，恒溫培養48小時觀察結果。當陽性對照管混濁(有菌生長)，陰性對照管澄清(無菌生長)，試驗組無菌生長的最低消毒劑的濃度為MIC值。每個試驗菌株各重復3次實驗。

二、結果

(一)細菌分離與鑒定。樣本中細菌分離鑒定結果顯示：108例鼻拭紙樣本接種至顯色培養基培養，共有44例樣本培養出紅色(粉紅色)菌落，為金黃色葡萄球菌(SAU)所在菌落，SAU檢出率40.7%。提取SAU菌株基因組，經SCCmecA基因擴增，有8株擴增出目標條帶，確定為MRSA菌株，檢出率7.4%。

(二)MIC測定結果。兩種消毒劑對MSSA和MRSA菌株的MIC測定結果表明：碘伏消毒劑對MSSA和MRSA菌株的MIC均為312.5mg/L，乙醇消毒劑對MSSA和MRSA菌株的MIC均為46,875mg/L，MRSA菌株和MSSA菌株對兩種消毒劑的最小抑菌濃度沒有明顯差別。

三、討論

消毒是預防和控制細菌感染的重要措施。研究發現，金黃色葡萄球菌家族攜帶的qabA/B基因可增強對其消毒劑的耐受性[2]。有報道指出，不同地區分離株各型的腸毒素基因分布存在差異[3]，對評估金黃色葡萄球菌的消毒劑抗性研究有重要意義。縱帥[4]等對徐州地區醫院住院患者送檢病原學標本分離的MRSA耐藥表型和抗消毒劑基因攜帶情況進行檢測，結果顯示，MRSA菌株中有28.0%攜帶抗消毒劑基因qacA/B,MSSA菌株中攜帶qacA/B基因僅占7.3%。表明MRSA菌株攜帶抗消毒劑基因比例明顯高于MSSA，提示MRSA和MSSA對消毒劑抗性或存在一定差異。林茹等對寧夏地區金黃色葡萄球菌的報道和沈林海等人的研究也有力地支持這一觀點[5～6]。也有報道指出，消毒劑對多種細菌的抑菌濃度并無明顯差異[7]。國內外研究發現，金黃色葡萄球菌攜帶的耐消毒基因qacA/B通過表達主動外排多重耐藥蛋白，從而介導對消毒劑抗性增加的現象[8～11]。

在校大學生作為典型的社區群體，其攜帶的金黃色葡萄球菌對常用消毒劑的抗性情況具有代表意義，可以為社區人群針對金黃色葡萄球菌的防控工作提供科學依據。本研究通過對比培養顯示，在校大學生群體鼻腔具有一定比例MRSA定植率，其攜帶MRSA和MSSA菌株對常用消毒劑碘伏和酒精的最小抑菌濃度無明顯差異。