白芨多糖的超聲輔助提取工藝及抗氧化活性研究

吳夢晴

（巢湖學院 化學與材料工程學院，安徽 巢湖 238000）

1 研究背景

白芨（Bletilla striata）是一種使用廣泛的傳統(tǒng)草藥，已被證實具有各種生物活性，如有效預防腸粘連、抑制纖溶、保護胃粘膜、抗腫瘤等。因其主歸肺、胃經(jīng)，尤其適宜于治療肺部和胃部出血，在現(xiàn)代社會是非常重要并值得研究的一味中藥[1]。將白芨提取物化學組分進行分析，已經(jīng)鑒定出近80種次級代謝產(chǎn)物，包括多糖、菲、三萜類、雙蒽類化合物等。研究表明白芨提取物對脂多糖（LPS）誘導的急性肺損傷的治療作用是通過炎癥反應和抗氧化作用進行調(diào)節(jié)的[2]。白芨塊莖中含有豐富的多糖，可用于治療消化道粘膜損傷、潰瘍、出血、瘀傷和燒傷[2]。白芨多糖是傳統(tǒng)中草藥中重要的功能因子，其在醫(yī)藥領(lǐng)域有巨大的應用前景，由于其抗衰老、抗菌、抗炎、抗癌（癌癥免疫療法）和對抗腎纖維化作用引起了很多關(guān)注[3]。藥理研究表明[3]，白芨多糖可誘導血管內(nèi)皮細胞和生長因子的增殖，增強免疫調(diào)節(jié)功能，作用于巨噬細胞并模擬細胞表達的一些促炎細胞因子。其原因可能是巨噬細胞表面含有可以結(jié)合多糖的受體和介導白芨多糖產(chǎn)生免疫刺激的信號轉(zhuǎn)導調(diào)控因子，其中甘露糖受體是最有可能識別多糖并與其結(jié)合的凝集素。天然多糖已被廣泛用于生物材料，它們表現(xiàn)出生物相容性、低毒性和藥物生理活性。據(jù)報道[4]，白芨多糖可作為緩控釋藥物、基因以及組織工程藥物的賦形劑，作為滴眼液、水凝膠、膠囊劑、涂膜劑的基質(zhì)，壓片糖衣的隔離層，也可制成一種新型粘膜粘附聚合物。研究表明[5]，從白芨中分離出的新型粘膜粘附多糖改善了左氧氟沙星局部治療實驗性細菌性角膜炎中的眼內(nèi)滲透。此外，白芨多糖廣泛應用于日化行業(yè)，研究表明[6]，添加了白芨多糖的化妝品在收斂抗皺、延緩皮膚衰老等方面均有明顯的療效，越來越受到化妝品行業(yè)的青睞。因此，優(yōu)化白芨多糖類化合物提取工藝是充分利用白芨藥用資源必須解決的問題之一。

目前，白芨多糖的提取方法主要是傳統(tǒng)提取法和新型提取技術(shù)。在傳統(tǒng)方法中，多糖的提取主要采用回流法，常規(guī)方法需要較長的處理時間且效率較低?；亓鲿r溫度不易控制，易耗費大量的揮發(fā)性和有害有機溶劑，造成環(huán)境污染。同時，回流過程容易引起多糖的變性與降解，導致樣品純度低[7]。天然多糖的提取技術(shù)也在不斷研究與完善，包括超臨界流體萃取、紅外輔助法、微波輔助萃取和超聲輔助提取等。其中超聲波技術(shù)將聲化學應用于天然產(chǎn)物提取，與傳統(tǒng)和其他現(xiàn)代提取技術(shù)相比，超聲法被提議作為樣品預處理的替代程序和更環(huán)保的提取技術(shù)，其允許在較短時間、較低的能量及溫度下進行重復性實驗，簡化操作并且顯著減少有機溶劑的消耗。因此，本研究采用超聲波輔助法對白芨多糖進行提取，通過苯酚-濃硫酸法對多糖的含量及得率進行分析，在考察單因素的基礎上設計正交實驗對其工藝條件進行系統(tǒng)的研究并通過紅外譜圖進行結(jié)構(gòu)初步鑒定，從DPPH·、·OH、ABTS+·、O2-·清除率對比分析傳統(tǒng)水提法和超聲提取法制得的白芨多糖的體外抗氧化能力。旨在保持原有多糖結(jié)構(gòu)的基礎上最大程度提高白芨多糖得率，且不影響其營養(yǎng)和活性。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

原料：白芨（云南普洱）：購于巢湖大藥房

主要試劑：無水乙醇、濃硫酸、50 mM Tris-HCl緩沖液、濃 HCl、磷酸鹽緩沖溶液（PH7.4）、苯酚、0.75 mM鄰二氮菲溶液、ABTS、硫酸亞鐵、0.01%H2O2、KBr、葡萄糖標準品、過硫酸鉀均為國產(chǎn)分析純；DPPH粉末（Sigma公司）

2.2 實驗方法

2.2.1 白芨粉末的制備

取適宜的白芨塊莖切片，稱重，置于白色紗布上并放入烘箱（50℃）干燥24 h，待干燥結(jié)束后放入粉碎機中，工作3 min，倒出白芨粉末，過50目篩，未達到要求的粉末繼續(xù)放入機器中粉碎，直至粉末能完全通過篩子，將其置于自封袋，貼標簽(含樣品名、日期、操作人員等信息），備用的樣品放入減壓干燥器防止材料吸潮。

2.2.2 白芨多糖的提取實驗

（1）傳統(tǒng)水提法提取白芨多糖

準確稱量白芨粉末5g、125mL蒸餾水于500mL三頸瓶，搭好冷凝回流裝置，置于攪拌器開動攪拌，設溫50℃，從有回流現(xiàn)象開始計時2 h，反應完畢，取下三頸瓶，冷卻至室溫再進行離心。將上清液緩慢轉(zhuǎn)移至茄形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至上清液的 1/3，加一定比例的 95%乙醇（1∶4），緩慢攪拌至有絮狀沉淀產(chǎn)生，4℃靜置過夜，離心，取沉淀，放入烘箱中干燥兩至三天（60℃），效果不好可用真空冷凍干燥器干燥。即得到白芨粗多糖。

（2）超聲輔助法提取白芨多糖

準確稱量白芨粉末5 g于250 mL燒杯中，按照一定料液比加入蒸餾水攪動使其均勻，放置一段時間，再放入數(shù)控超聲清洗器里，控制溫度在50℃，在一定超聲功率下進行超聲，反應完畢，拿出燒杯，冷卻至室溫再進行離心。后續(xù)步驟同2.2.2（1）。

2.2.3 多糖得率的計算

參照劉長命等[8]的方法繪制葡萄糖標準曲線，稱取真空包裝的葡萄糖標準品10 mg，加入10 mL的蒸餾水配成1 mg/mL的葡萄糖標準貯備溶液，設置五個濃度梯度（20～100 ug/mL），采用苯酚-濃硫酸法于490 nm處測定吸光度，制做標準曲線得到回歸方程。再稱量干燥好的白芨粗多糖10 mg溶于100 mL的蒸餾水中配成樣品溶液，吸取1 mL樣品，采用苯酚-濃硫酸法帶入回歸方程中算得濃度，白芨得率計算公式為：

白芨多糖得率（%）=樣品濃度C×稀釋體積×（干燥后所得粗多糖質(zhì)量m1/測量吸光度所取白芨多糖質(zhì)量 m2）/白芨粉末質(zhì)量 m3×100%

2.2.4 白芨多糖超聲輔助提取單因素實驗

（1）超聲時間的影響

稱取5 g預實驗處理的白芨粉末5份，按照料液比1∶30 g/mL加入相應的蒸餾水，放入超聲清洗儀中設定功率為250 W，分別超聲提取30 min、40 min、50 min、60 min、70 min。 再按照 2.2.2（1）步驟進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、醇提、靜置、離心、干燥、得到白芨粗多糖，計算得率得到較適的超聲時間。

（2）料液比的影響

稱取5 g預實驗處理的白芨粉末5份，料液比為 1∶20 g/mL、1∶25 g/mL、1∶30 g/mL、1∶35 g/mL、1∶40 g/mL，時間設置為較適的超聲時間，功率設置在250 W，再按照上述步驟進行離心、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、醇提、靜置、離心、干燥、得到白芨粗多糖，再測量吸光度，得到較適的料液比。

（3）超聲功率的影響

稱取5 g預實驗處理的白芨粉末5份，以較適料液加入蒸餾水，時間設置為較適時間，功率分別設置 200 W、250 W、300 W、350 W、400 W，再按照上述步驟進行離心、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、醇提、靜置、離心、干燥、得到白芨粗多糖，再測量吸光度，得到較適的超聲功率。

2.2.5 白芨多糖超聲輔助提取正交實驗

根據(jù)單因素實驗研究結(jié)果設計正交實驗，因素水平如表1所示。

表1 白芨多糖超聲輔助提取正交實驗因素水平表

2.2.6 紅外光譜結(jié)構(gòu)鑒定

取KBr進行預先干燥一上午，取1 mg左右在超聲輔助提取法最優(yōu)條件下制得的干燥樣品于瑪瑙研缽中進行研磨，再與100～200 mg經(jīng)預處理的KBr粉末混勻。壓片機壓成薄片，上機按照相應程序操作，掃描4000～400 cm－1波數(shù)范圍的圖譜。導出數(shù)據(jù)，用Origin軟件分析圖譜信息。

2.2.7 白芨多糖體外抗氧化實驗

（1）DPPH·清除率的試驗方法

取白芨多糖配制成3種濃度梯度 （0.1 mg/mL、0.3 mg/mL、0.5 mg/mL）的樣品溶液，參考程丹秋等[9]的方法測定DPPH·清除率。計算公式如下：

DPPH·清除率（%）=[（Ac-As）/Ac]×100

其中：As為樣品517 nm處的吸光度，Ac為蒸餾水代替多糖溶液加入DPPH-乙醇溶液作空白對照

（2）·OH清除率的試驗方法

取白芨多糖配制成3種濃度梯度 （0.1 mg/mL、0.3 mg/mL、0.5 mg/mL）的樣品溶液，參考韋坤華等[10]的方法測定·OH清除率。計算公式如下：

·OH 清除率（%）=[（A1-A0）/（A2-A0）]×100

其中：A1為樣品吸光度；A2為去離子水代替樣品及H2O2的吸光度，A0去離子水代替多糖樣品溶液作空白對照。

（3）ABTS+·清除率的試驗方法

取白芨多糖配制成3種濃度梯度（0.1 mg/mL、0.3 mg/mL、0.5 mg/mL）的樣品溶液，參考李政紅等[11]的方法測定ABTS+·清除率。計算率公式如下：

ABTS+·清除率（%）=[（Ac-As）/Ac]×100

其中：As為樣品吸光度；Ac為去離子水代替多糖樣品溶液作空白對照。

（4）O2-·清除率的試驗方法

取白芨多糖配制成3種濃度梯度 （0.1 mg/mL、0.3 mg/mL、0.5 mg/mL）的樣品溶液，參考姜忠杰等[12]的方法測定O2-·清除率。計算公式如下：

O2-·清除率（%）=[（Ac-As）/Ac]×100

其中：As為樣品320 nm處的吸光度，Ac為去離子水代替多糖樣品溶液作空白對照。

3 結(jié)果與分析

3.1 葡萄糖標準曲線的建立

圖1 葡萄糖標準曲線

3.2 白芨多糖單因素實驗結(jié)果

3.2.1 超聲時間對白芨多糖得率的影響

超聲時間是影響多糖含量的主要因素之一，不同的超聲時間對多糖得率的影響不同。從圖2可見，隨著時間從30 min增加到40 min時，多糖得率緩慢上升，當時間增加到50 min時多糖得率增長幅度最大，且達到最大值6.45%，隨后得率呈現(xiàn)下降趨勢。超聲時間對得率的影響呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢的原因有可能是隨著時間的延長，其介質(zhì)分子的運動速度、穿透力有所增加，在其他提取條件一致時，適當增加超聲時間可以增加多糖溶出。但是超聲時間過長可能導致其對細胞壁和細胞膜的破碎已經(jīng)沒有作用，此外多糖分子含有大量糖苷鍵，時間過長易導致鍵的斷裂從而發(fā)生降解。

超聲時間應控制在適當?shù)姆秶鷥?nèi)，既要保證提取盡可能的充分，又要保證多糖的純度。實驗證明，超聲波作為一種高效的催化手段確實可以大大縮短反應所需的時間，從而達到節(jié)約成本的目的。因此，選用超聲50 min進行料液比單因素的分析。

圖2 超聲時間對白芨多糖得率的影響

3.2.2 料液比對白芨多糖得率的影響

料液比也是影響多糖得率的主要因素之一。從圖3可見，隨著料液比從1:20 g/mL增加到1:40 g/mL，多糖得率先升高后降低，在1:30 g/mL時多糖得率達到最大值7.3%。實驗過程中發(fā)現(xiàn)當料液比為1:20 g/mL時，經(jīng)過提取、濃縮、離心等步驟，溶劑量過少，醇沉以后白芨多糖呈現(xiàn)膠狀且過于黏稠，不易離心去除上清液，同時為多糖的干燥帶來了不便。當增加溶劑體積時，一方面增加了溶劑與提取物的接觸面積，一方面便于實驗操作減少耗損。但溶劑量過高對超聲波的細胞破碎作用造成一定阻力，減壓濃縮需要消耗大量時間，后續(xù)可能需要分次離心從而造成不小的損耗。因此，選用料液比1:30 g/mL進行超聲功率單因素的分析。

圖3 料液比對白芨多糖得率的影響

3.2.3 超聲功率對白芨多糖得率的影響

超聲功率是影響多糖得率的重要因素之一，不同的超聲功率對得率的影響也不同。從圖4可見，超聲功率從200 W到400 W，多糖得率先升高后緩慢降低，在350 W時其值達到最大值7.65%。原因可能是適當增加超聲功率，有利于細胞膜和細胞壁的破壞，促使多糖溶出。超聲功率過大有可能將部分溶出的多糖分解成小分子的單糖，醇沉時小分子糖溶于乙醇從而降低多糖含量。觀察多糖顏色時發(fā)現(xiàn)，當超聲功率變大，多糖呈現(xiàn)出淡黃色，有可能是超聲帶有能量從而使得部分原料出現(xiàn)糊化，體系中雜質(zhì)變多導致得率降低。

圖4 超聲功率對白芨多糖得率的影響

3.3 正交實驗優(yōu)化提取工藝

3.3.1 正交實驗結(jié)果分析

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選取了A（超聲功率）、B（料液比）、C（超聲時間）作為考察因素，采用L9（34）正交實驗設計表進行三因素三水平的正交實驗。以多糖的得率作為考察指標來進行實驗，實驗結(jié)果如表2。

從表中可以看出最優(yōu)工藝選定為A3B3C2，即超聲功率為400 W，料液比為 1∶35 g/mL，超聲時間為50 min。由R值可知影響白芨多糖得率的因素的主次關(guān)系為：超聲時間>超聲功率>料液比，超聲時間和超聲功率對多糖得率有顯著的影響，而料液比對多糖得率的影響最小。

表2 白芨多糖超聲輔助提取正交實驗結(jié)果

3.3.2 驗證實驗

取3份預實驗的白芨粉末5 g，選擇較適的工藝即超聲功率400 W，料液比 1∶35 g/mL，超聲時間50 min進行三次平行試驗，并對三次平行實驗所得結(jié)果求平均值。經(jīng)過實驗驗證在此條件下白芨多糖的得率達到8.18%（表3）。

表3 驗證實驗結(jié)果

3.3.3 提取工藝對比

從表4可知，在不同的提取方法下，多糖得率也不盡相同。分別根據(jù)2.3.2（1）傳統(tǒng)水提法和的超聲法最佳工藝提取白芨多糖，實驗結(jié)果顯示超聲輔助法提取的白芨多糖得率為8.18%+0.04%，明顯高于傳統(tǒng)水提法。蔡錦源等[13]采用超聲-微波協(xié)同提取的白芨多糖得率為6.98%±0.19%。韓丹等[14]將傳統(tǒng)水提法、酶解法、超聲波輔助法等方法進行了對比，結(jié)果表明超聲法制的的多糖含量最高。相關(guān)研究均證實超聲法提取效果最優(yōu)。

表4 提取工藝對比實驗結(jié)果

3.4 紅外光譜分析

如圖5所示，波數(shù)3430 cm-，2910 cm-的吸收峰分別是O-H的伸縮振動峰以及C-H的伸縮振動峰[15-16]，1640 cm-的吸收峰是C-O的不對稱伸縮振動峰[17]，波數(shù) 765 cm-，914 cm-的吸收峰表明存在吡喃糖殘基，波數(shù)864 cm-的特征吸收表明存在甘露糖殘基。這與芮海云等[18]制備的白芨多糖紅外光譜特征峰基本吻合。

3.5 白芨多糖體外抗氧化實驗結(jié)果

3.5.1 提取方法對DPPH·清除率的影響

圖5 白芨多糖紅外光譜圖

如圖6所示，使用水提法和超聲輔助法提取的白芨多糖對DPPH·的清除率均會隨著多糖濃度的增加而升高，且增幅較大。當濃度達到0.5 mg/mL時，水提法和超聲輔助法對DPPH·的清除率分別52.5%、64.7%，略低于蔡錦源等[13]超聲-微波協(xié)同提取的白芨多糖對DPPH·的清除率，但均高于Qu Y等[19]傳統(tǒng)水提工藝的研究結(jié)果，而單獨超聲法提取的白芨多糖對DPPH·清除率的影響目前尚未有相關(guān)報道。本次研究結(jié)果表明超聲法提取的白芨多糖DPPH·清除能力優(yōu)于水提法提取，原因可能是不同的提取方法制得的白芨多糖純度存在差異。

3.5.2 提取方法對·OH清除率的影響

如圖7所示，使用水提法和超聲輔助法提取的白芨多糖對·OH的清除率會隨著多糖濃度的增加而增加，且增幅較大。當濃度達到0.5 mg/mL時，水提法和超聲輔助法對對·OH的清除率分別為74.6%、86.2%。相較而言，超聲法提取的白芨多糖·OH清除能力優(yōu)于水提法提取，但略低于蔡錦源等[13]超聲-微波協(xié)同提取的白芨多糖對·OH的清除率。

圖6 提取方法對白芨多糖DPPH·清除率的影響

圖7 提取方法對白芨多糖OH·清除率的影響

3.5.3 提取方法對ABTS+·清除率的影響

如圖8所示，當多糖濃度為0.1 mg/mL、0.3 mg/mL時，兩種方法提取的白芨多糖對ABTS+·清除能力無明顯差異，但當濃度達0.5 mg/mL時，超聲法提取得到的白芨多糖對ABTS+·清除能力優(yōu)于水提法，清除率分別為39.4%、47.3%。

圖8 提取方法對白芨多糖ABTS+清除率的影響

3.5.4 提取方法對O2-·清除率的影響

如圖9所示，水提法和超聲輔助法提取的白芨多糖對O2-·基本沒有清除能力，當濃度達到0.5 mg/mL時，水提法和超聲輔助法對O2-·的清除力也只有為7.5%、9.8%，與蔡錦源等[13]的研究結(jié)果基本一致。分析其中原因，一方面單糖通過糖苷鍵聚合成多糖類高分子化合物，其構(gòu)象復雜且不易伸展，柔性較低，導致羥基被包裹在網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)內(nèi)部，羥基相互締合形成分子內(nèi)氫鍵；另一方面可能由于多糖對O2-·清除作用的反應體系中存在促進自由基引發(fā)的誘導劑，因此表現(xiàn)出促進O2-·產(chǎn)生的作用[20]。

圖9 提取方法對白芨多糖O2-·的影響

4 結(jié)論

本研究采用超聲輔助法提取白芨多糖，在單因素實驗基礎上進行正交實驗，以此來得到白芨多糖的提取最佳工藝并進行驗證。根據(jù)實驗結(jié)果可知超聲功率為400 W，料液比為1:35 g/mL，超聲時間為50 min時提取工藝最優(yōu)。超聲輔助法較水提法而言可以顯著提高白芨多糖的得率且超聲法提取的白芨多糖有較高的DPPH·、·OH清除活性，ABTS+·清除能力稍低點，當多糖濃度為0.5 mg/mL 時 DPPH·、·OH、ABTS+·的清除率分別為64.7%、86.2%、47.3%，兩種方法提取得到的多糖均無明顯的O2-·清除能力。