PKU患者PAH基因突變分析

李菲 張雪純 張鐿山 宋寶麗

【摘要】目的 通過對苯丙酮尿癥（Phenylketonuria，PKU）患者苯丙氨酸羥化酶（phenylalanine hydroxylase，PAH）基因突變的分析，為苯丙酮尿癥的產前診斷、遺傳咨詢、治療和采取干預措施提供一定的科學依據。方法 應用PCR產物直接測序法對123例PKU患者PAH基因第1～13外顯子及其兩側內含子進行序列分析。結果 在123例患者的246個PAH等位基因中檢測出了216個PAH基因突變位點，總檢出率為87.8%（216/246），其中外顯子3、6、7、10、11和12檢出率相對較高。共發現59種突變，包括42種錯義突變、8種剪接突變、5種無義突變、2種移碼突變、2種同義突變。高頻突變位點主要是p.R243Q（23.15%），p.R111X（8.33%），EX6-96A>G（7.87%），p.R413P（7.87%）、p.V1399V（6.48%）。結論 PKU患者具有明顯的突變熱點（R243Q、R111X、EX6-96A>G、R413P、V1399V）和突變熱點區域（外顯子3、6、7、10、11、12）。通過PAH基因直接測序可對大部分的PKU家系進行產前診斷。

【關鍵詞】苯丙酮尿癥;苯丙氨酸羥化酶;基因突變;產前診斷

【中圖分類號】R589 【文獻標識碼】A 【文章編號】ISSN.2095-6681.2019.2..03

苯丙酮尿癥是一種氨基酸代謝異常的常染色體隱性遺傳病[1]。主要由于苯丙氨酸羥化酶基因突變導致PAH活性降低或喪失，使苯丙氨酸不能轉化為酪氨酸，導致血液中苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）濃度增高并在神經系統和血液中蓄積。PKU患者如未及時治療，將由于過量的Phe及其代謝產物的神經毒性作用而導致嚴重的智力障礙、精神發育遲滯和繼發性癲癇等。PKU的發病率有種族和地區差異[2-6]，我國約為1/11144[7]，且PAH基因突變具有相對突變熱點及突變熱點區域，因此可以通過對PKU患者進行基因診斷分析，了解各種突變的種類和分布，了解所研究的人群中PAH基因相對突變熱點和突變熱點區域，進而對產前診斷和治療提供一定科學依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

230例PKU患者，來自鄭州大學第一附屬醫院產前診斷中心遺傳咨詢門診，其中，男123例，女107例，年齡16天～37歲。230例患者來自230個無關家庭，所有患者的父母均非近親結婚。這230例患者治療前血苯丙氨酸濃度Phe>480 μmol/L，平均（915.52±513.66），通過Phe負荷試驗和尿蝶呤分析結合臨床癥狀排除了四氫生物喋呤缺乏癥。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和PCR擴

抽取患者的外周血并用EDTAK2抗凝，-20℃儲存。200名正常DNA來自實驗室積累的健康無血緣關系個體。采用北京天根D315DNA分離試劑盒提取采集的抗凝外周血樣品中的DNA。參照文獻[2]設計PAH基因第1～13外顯子的引物。常規PCR擴增條件：95℃5 min熱變性，94℃變性30 s，55～62℃復性30 s，72℃延伸45 s，共30個循環，72℃延伸10 min。PCR反應在美國ABI公司Verteri梯度PCR儀上完成。PCR產物用2%瓊脂糖檢測。

1.2.2 DNA序列分析

采用PCR產物直接測序法對樣品中DNA進行序列分析。PCR產物的純化和DNA序列分析由上海生物工程科技有限公司應用美國ABI公司3730XL全自動DNA序列分析儀完成。所有PCR產物均采用正反向測序。

2 結 果

2.1 PAH基因突變的檢出率

通過對123例PKU患者PAH基因外顯子和內含子分析，在246條染色體中共檢測到216個突變（表1），總檢出率為87.8%。所有患者均檢測到突變基因，其中93個人檢測出2個突變位點，占75.6%。30個人檢測出一個突變位點。

2.2 PAH基因突變種類

檢測到的216個突變分屬59種突變，其中錯義突變42種、剪接突變8種、無義突變5種、移碼突變2種、同義突變2種。

2.3 PAH基因突變分布特點

患者突變主要分布在第3，6，7，10，11，12外顯子，其中第7外顯子檢測到的突變最多，共12次。其次為第11外顯子，共9次。第12、10、3、6外顯子分別為7、6、5、5次。

2.4 PAH基因高頻突變位點

突變頻率最高的是p.R243Q，共檢測到50次，p.R111X檢測到18次，EX6-96A>G檢測到17次，p.R413P檢測到17次，p.V1399V檢測到14次。

3 討 論

PKU是少數幾種可治療的嚴重單基因遺傳病，而基因診斷是PKU唯一有效的產前診斷措施，可通過基因診斷對新生兒進行篩查發現PKU患者，及時治療，可減輕患兒的病情。但PKU患兒需進行長期治療，給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔及精神壓力，通過基因診斷，避免生育PKU患兒是一種很好的對策。

1983年，PAH基因被成功分離、克隆[8]。PAH基因定位于染色體12q22-q24.1，由13個外顯子和12個內含子組成，編碼區全長90kb，編碼含有452個氨基酸殘基的酶單體，單體聚合成有功能的PAH，參與苯丙氨酸代謝。任何一種突變都有可能導致PAH結構的改變，從而導致苯丙氨酸羥化酶活性的改變，影響苯丙氨酸的代謝過程。迄今已經發現苯丙氨酸羥化酶基因一千余種突變（http：/ www.Pahdb.mcgil1.ca），國內報道的有100多種[9-11]。本文對123個先證者進行基因診斷，一共檢測到59種突變，216個突變位點，總檢出率為87.8%。應用MLPA技術，檢測出123個先證者中有4種大片段缺失，包括5'UTR_E1雜合缺失，E4_E5雜合缺失，E5雜合缺失，E4_E7雜合缺失。上述結果提示PKU患者基因突變類型多樣，位置多變，突變位置可發生在外顯子、內含子及5'UTR、3'UTR。

現在世界各地PAH基因突變研究者都在致力尋找PAH基因的高頻突變位點，以便通過產前診斷篩查出PKU患者。本文結果顯示PAH基因突變有相對集中特點，高頻突變位點分別是p.R243Q（23.15%），p.R111X（8.33%），EX6-96A>G（7.87%），p.R413P（7.87%）、p.V1399V（6.48%）。突變熱點區域主要是外顯子3（8.5%），6（8.5%），7（20.3%），10（10.2%），11（15.3%），12（11.9%），其中第7外顯子檢測到的突變最多為12次。參考Lee[12]等報道中國人的高頻突變主要位于第7外顯子的R243Q（23.15%），本文結果與之比較一致。在123個先證者中，有93個人都檢測出兩個突變位點，提示在PKU患者中兩個突變位點的突變率較高，這可以作為鑒別診斷的輔助手段之一。與此同時，這些檢測出兩個突變位點的家系，如果其父母再次懷孕時，可以直接選擇基因診斷突變位點來確診胎兒是否是PKU患者，以免再次生出PKU患兒，為家庭帶來不必要的麻煩。

很多學者的研究已經表明，在不同種族和地區PKU患者基因突變位點的分布具有明顯差異性，因此研究PKU的分布及類型，對于開展產前診斷、遺傳咨詢有一定的意義。如當對PKU患者群體進行突變分析時，由本研究的實驗數據，可優先選擇第3、6、7、10、11和12外顯子直接測序，即可篩查出約74.6%的突變，之后可以再對其他外顯子測序，這樣可以避免全編碼區測序產生的不必要的浪費，并提高產前診斷的效率。

本研究明確了PAH基因突變的類型、分布和高頻突變位點，為PAH基因突變的研究增加了一定的資料，豐富了中國人群的PAH基因突變譜。但本研究數據比較少，下一步就是擴大樣本數據，進一步對樣本中基因突變類型、分布與高頻突變位點進行分析。通過對PAH基因突變數據的分析，可以為產前診斷、遺傳咨詢提供理論依據，對減低PKU的發病率，減輕患兒的病情，減少PKU患兒的出生以及提高人口整體素質具有重要意義。

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本文編輯：劉欣悅