2 株植物內生菌對油菜和小麥種子萌發及幼苗生長的影響

楊亞茹，茆少星，閆淑珍，陸長梅

（南京師范大學生命科學學院，江蘇 南京 210024）

植物內生菌是指生活在植物組織和器官內部的微生物，其不會使宿主植物表現出外在病癥，但可通過組織學方法或從表面嚴格消毒的植物組織中分離出來。與宿主植物共生過程中，內生菌可以通過產生激素、促進營養元素釋放和吸收等方式調節植物生長，直接抑制病蟲害以提高宿主植物的抗性；可通過ISR 效應等提高宿主植物對生物與非生物脅迫的抗性等[1～4]。大多數內生菌對宿主具有專一性，因此其使用范圍相對較窄；再加上不同菌劑的作用機制和作用效果相差很大、微生物菌劑功能單一等因素，均制約了微生物菌劑的發展[1，4]。

蠟狀芽孢桿菌SZ5（Bacillus cereus） 和熒光假單胞菌DLJ1（Pseudomonas fluorescens biovar I） 是在篩選產1-氨基環丙烷-1-羧酸（1-a minocyclopropane-1-carboxylate，ACC） 脫氨酶微生物時，分別從柿子和辣椒的成熟果實中分離獲得的2 株植物內生菌。它們均能在非宿主植物番茄中定殖，并促進番茄生長和抗性提高[5]；能提高辣椒植株對南方根結線蟲的抗性，其中，SZ5 還具有降低大麗輪枝菌（Verticillium da hliae） 毒素毒性的作用[6]。

由于DLJ1 和SZ5 對某些病蟲害具有一定的抑制作用，且宿主具有一定的多樣性，因此探究二者能否促進其他植物（如大宗農作物） 的生長，對于擴展其應用范圍具有一定的價值。鑒于此，以小麥（單子葉植物） 和油菜（雙子葉植物） 為試材，探究DLJ1 和SZ5 菌劑對小麥和油菜種子萌發及幼苗生長的影響，并初步探討其作用機理和適宜處理時機，旨為拓展DLJ1 和SZ5 菌劑在農業生產上的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

油菜和小麥種子由江蘇省農業科學院提供。供試植物內生菌蠟狀芽孢桿菌SZ5（自成熟柿子分離） 和熒光假單胞菌（生物型I） DLJ1（自辣椒果實分離），均由南京師范大學微生物工程研究中心篩選獲得，以牛肉膏蛋白胨培養基培養皿冷藏保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌劑及種子的前處理

1.2.1.1 制備菌劑。參照劉維紅等[5]的方法，將2 個菌株在NA 培養液中培養48 h 獲得純培養物；取純培養物在4 ℃下8 000 轉/min 離心5 min，收集沉淀和上清液（發酵液），備用。將沉淀菌體用無菌水洗滌2 次后，再用無菌水重懸沉淀至OD600為0.5±0.02，制得濃度相當于108cfu/mL 的菌懸液，備用。

1.2.1.2 種子處理。將供試種子先后于70%酒精中消毒1 min、1%的NaClO 溶液中消毒10 min，然后用無菌水充分洗滌5 次，于25～28 ℃黑暗條件下浸種12 h，備用。

1.2.2 種子萌發試驗 采用培養皿濾紙法[7]進行種子萌發試驗，整個操作在無菌條件下進行。試驗設6 個培養液處理，分別為無菌水（CK）、NA 培養液、SZ5菌懸液、SZ5 發酵液、DLJ1 菌懸液和DLJ1 發酵液。每個培養皿中放入1 張濾紙，加入培養液5 mL 浸潤，于濾紙上放置飽滿的備用種子30 粒，每處理3 次重復。油菜于28℃（晝）/25℃（夜）、14h（光照）/10h（黑暗）條件下培養；小麥于25 ℃條件下黑暗培養。每隔12 h觀察1 次。每天采用稱重法補充蒸發掉的水分，并記錄萌發種子數。在萌發終止（4 d） 時，計算各處理的發芽率（發芽種子數∕供試種子數×100%）、發芽勢（發芽高峰期發芽的種子數/供試種子數×100%，本文中發芽高峰為第2 天） 和萌發指數〔∑（Gt/Dt），式中，Gt 為在時間t 的種子萌發數，Dt 為相應的萌發時間〕。測定萌發苗的發育情況[8]。

1.2.3 幼苗生長試驗 將備用種子置于無菌水培養皿中，黑暗培養至萌發后，備用。采用培養皿濾紙法進行幼苗生長試驗。試驗設6 個培養液處理，分別為無菌水（CK）、NA 培養液、SZ5 菌懸液、SZ5 發酵液、DLJ1 菌懸液和DLJ1 發酵液。每個培養皿中放入1 張濾紙，加入培養液5 mL 浸潤，于濾紙上放置萌發狀態一致的萌發苗30 株，每處理3 次重復。在28 ℃（晝）/25 ℃（夜） 培養箱中，先黑暗培養4 d，然后再14 h（光照） /10 h（黑暗） 培養2 d 后，對幼苗生長狀況進行測定。

將幼苗經掃描儀掃描后，利用根系分析儀Epson Perfection V700 Photo（J221A，日本） 和葉面積分析儀Epson Perfection V500 Photo（日本），分析計算各處理幼苗的根系長度、根系表面積、胚軸長度、葉長和不定根數。

1.2.4 激素相關物質檢測 生長素吲哚乙酸（indole acetic acid，IAA） 定性檢測參照Glickmann 等[9]的方法，采用Salkowski 比色液，在室溫下避光反應，比較反應液是否變成粉紅色。赤霉素（gibberellin，GA）活性測定參照薛泉宏等[10]的熒光法。ACC 脫氨酶活性檢測則是將DLJ1 和SZ5 純培養菌體重懸于ADF 培養液中誘導培養24 h 后，參照Honma 等[11]和Saleh 等[12]的方法，以每毫克可溶性蛋白每小時產生的α-丁酮酸的量代表ACC 脫氨酶活性大小。可溶性蛋白質含量測定采用Bradford 法[13]，以牛血清白蛋白作為標準蛋白進行測定。

1.2.5 Fe 載體的定性檢測 將2 個菌株接種于金葡菌甘露醇氯化鈉瓊脂（mannitol salt agar，MSA） 培養基中，于28 ℃、160 轉/min 條件下培養48 h 后，觀察培養液的顏色，并離心菌液獲得上清液；在紫外-可見光光度計下連續掃描上清液，觀察在405 nm 波長處是否存在吸收峰。培養液呈現藍綠色熒光、405 nm 處存在吸收峰，代表菌株可以產生Fe 載體[14]。

1.3 數據統計與分析

利用Excel、Photoshop 和SPSS 18.0 軟件進行相關數據的整理與分析，采用Duncan’s 新復極差法對數據進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 萌發期菌劑處理對油菜和小麥種子萌發以及萌發苗生長的影響

2.1.1 對種子萌發的影響

2.1.1.1 油菜種子。與無菌水對照處理相比，萌發期NA 培養液處理對油菜種子的最終發芽率以及萌發速度（發芽勢） 和質量（發芽指數） 均有顯著的抑制作用，且抑制作用均為最大；SZ5 和DLJ1 菌懸液處理對油菜種子的最終發芽率、萌發速度和質量有一定的抑制作用，但均未達到顯著水平；SZ5 發酵液處理對油菜種子的最終發芽率、萌發速度和質量均有顯著的抑制作用，DLJ1 發酵液處理僅對油菜種子的萌發速度有顯著的抑制作用（表1）。總體來看，SZ5 處理對種子萌發的抑制程度高于DLJ1 處理。

2.1.1.2 小麥種子。與無菌水對照處理相比，雖然各處理均對種子發芽率無顯著影響，但2 個菌劑的發酵液處理均導致小麥發芽勢和發芽指數降低，且除DLJ1 發酵液處理的小麥發芽指數外，其他指標與CK 差異均達到了顯著水平；NA 培養液處理的抑制作用弱于發酵液處理，與CK 相比，指標差異均不顯著；2 種菌劑菌懸液處理對小麥種子萌發速度和質量的作用不同，其中SZ5 菌懸液處理表現為促進作用、DLJ1 菌懸液處理表現為抑制作用，但均未達到顯著水平。

表1 萌發期SZ5 和DLJ1 菌劑處理對油菜和小麥種子萌發的影響Table 1 Effects of inoculation of SZ5 and DLJ1 at germination stage on seed germination of rape and wheat

可以看出，萌發期分別用2 個菌劑的不同培養液處理油菜和小麥種子，雖然對最終發芽率影響較小，但2 個菌劑的發酵液處理均顯著延緩了種子萌發。NA培養液處理對油菜種子萌發抑制作用明顯，說明NA培養液或發酵液中可能存在抑制種子萌發的物質。

2.1.2 對萌發苗生長的影響 伴隨著種子生長，不同培養液處理對油菜和小麥種子萌發苗生長的影響程度不同（表2）。NA 培養液處理顯著降低了油菜萌發苗的主根長度，明顯提高了其子葉面積；而對小麥苗的生長無顯著影響。2 個菌劑菌懸液處理中，除SZ5 菌懸液處理顯著降低油菜萌發苗的主根長度外，其他處理對油菜苗的生長均無顯著影響；但可顯著促進小麥胚根生長，其中DLJ1 菌懸液的促生效應更為顯著。SZ5 發酵液處理雖然可顯著促進油菜萌發苗子葉擴大，但顯著抑制了其主根的生長；而對小麥萌發苗的生長存在不明顯的抑制作用；DLJ1 發酵液處理則對油菜萌發苗的下胚軸、根系和子葉生長以及小麥胚根生長均有顯著的促進作用。

表2 萌發期SZ5 和DLJ1 菌劑處理對油菜和小麥萌發苗生長的影響Table 2 Effects of inoculation of SZ5 and DLJ1 at germination stage on the growth of rape and wheat seedlings

綜合來看，雖然萌發期2 個菌劑的發酵液處理延緩了油菜和小麥種子萌發，但DLJ1 發酵液可顯著促進油菜萌發苗生長，DLJ1 發酵液、菌懸液以及SZ5菌懸液可顯著促進小麥萌發苗生長，且DLJ1 處理萌發苗的長勢優于SZ5 處理。

2.2 萌發后菌劑處理對油菜和小麥幼苗生長的影響

與無菌水對照相比，NA 培養液處理僅對油菜根伸長有明顯的抑制作用；SZ5 發酵液和DLJ1 發酵液處理雖然也對油菜根系伸長有一定抑制作用，但抑制幅度小于NA 培養液；2 個菌劑的菌懸液處理均對油菜幼苗生長無顯著影響（表3）。

在小麥的各處理中，只有DLJ1 菌懸液可顯著促進小麥幼苗根系伸長，SZ5 發酵液可顯著降低小麥幼苗根系表面積，其他處理均對小麥幼苗生長無顯著影響。

表3 萌發后SZ5 和DLJ1 菌劑處理對油菜和小麥幼苗生長的影響Table 3 Effects of inoculation of SZ5 and DLJ1 after germination on the growth of rape and wheat seedlings

綜合來看，在油菜和小麥種子萌發后再進行菌劑處理，短時間（6 d） 內對幼苗生長的促進效應較弱。

2.3 菌劑的作用機制

微生物菌劑對植物的作用機制集中在產植物激素及與植物激素相關的物質、為植物生長提供必需的營養元素、抑制病原微生物生長、提高植物免疫能力等方面[1～4]。本研究結果顯示，萌發期SZ5 和DLJ1 菌劑的發酵液處理均對油菜和小麥種子萌發具有明顯的延緩作用；但在種子萌發后，DLJ1 發酵液處理對萌發苗生長有明顯的促進作用，且2 個菌株發酵液的作用效果均大于其菌懸液。由此推測，可能是發酵液中存在某種物質對種子萌發和生長產生了影響。

2.3.1 菌劑發酵液中植物激素等相關物質 在SZ5 和DLJ1 的發酵液中均未檢測出IAA 或GA 等促進種子萌發的激素，但檢測到了降解乙烯合成前體ACC 的ACC 脫氨酶（表4）。DLJ1 發酵液中ACC 脫氨酶活性高達54.657 6 μmol/（mg·h），是SZ5 的4 倍。在已報道的可分泌ACC 脫氨酶的微生物中，DLJ1 分泌的ACC脫氨酶活性相對較高[5，6，15～18]。

伴隨著植物種子萌發，會出現乙烯釋放高峰[18，19]。ACC 為乙烯合成前體，ACC 脫氨酶可以通過降解乙烯合成前體ACC，從而減少種子萌發過程中乙烯的產生[17～20]。雖然DLJ1 發酵液中ACC 脫氨酶活性高于SZ5 發酵液，但其對油菜和小麥種子萌發的抑制作用卻弱于SZ5 發酵液。由于發酵液中混有NA 培養液，且NA 培養液對油菜和小麥種子萌發亦有明顯的抑制作用，推測發酵液對種子萌發的抑制可能更多與NA培養液中的成分有關。

表4 SZ5 和DLJ1 菌劑發酵液中植物激素相關檢測結果Table 4 Plant hormone related detection results of SZ5 and DLJ1 fermentation broth

萌發期乙烯的主要作用并不是促進種子萌發，而是通過三重反應提高幼苗的頂土能力[19]。在幼苗出土后如果仍有大量乙烯產生，這些過量乙烯將會抑制幼苗生長[18]。此時微生物產生的ACC 脫氨酶就可以通過降解ACC 來降低乙烯產生量，減少乙烯對幼苗生長的抑制，促進幼苗生長[18]。ACC 脫氨酶活性越強，其促生能力也將越強[16]。這可能是產ACC 脫氨酶微生物的促生機制[16]，也是本試驗中萌發期DLJ1處理對油菜和小麥萌發苗生長的促生作用強于SZ5 處理的主要原因。

伴隨著種子萌發，植物根際有一短暫的ACC 分泌峰出現[19]。產ACC 脫氨酶的微生物可以利用ACC 作為唯一N 源生長。在萌發期接種菌劑，由于種子萌發期ACC 分泌峰的出現，使得產ACC 脫氨酶活性越強的微生物可以獲得更多的營養，可能會使得內生菌在植物根際生長繁殖能力更強，進而對植物生長產生更大影響；在種子萌發后接種菌劑，此時根際ACC 分泌峰已經過去，產ACC 脫氨酶的微生物可利用的ACC 量減少，可能導致這類微生物在植物根際的定殖能力減弱，進而影響其促生功能的發揮。這可能是種子萌發后接種內生菌促生效應較低的原因。

2.3.2 菌劑產Fe 載體能力 DLJ1 的MSA 發酵液發出藍綠色熒光，在415 nm 處具有明顯的吸收峰；SZ5 的MSA 發酵液既不產生熒光，在415 nm 處也無光吸收（表5）。表明DLJ1 具有產生Fe 載體的能力，而SZ5無此能力。一方面，Fe 載體有利于微生物從周圍環境吸收Fe，造成周圍Fe 缺乏，從而抑制病原微生物生長，間接促進植物生長[20]；另一方面，Fe 載體還可為植物提供Fe 營養，直接促進植物生長[20]。雖然DLJ1 處理對油菜和小麥的促生作用大于SZ5 處理，但是否與其具有產Fe 載體能力有關還有待進一步研究。但可以預測，DLJ1 在抑制需Fe 量較高的病原微生物上可能具有一定作用。

表5 SZ5 和DLJ1 菌劑產Fe 載體能力檢測Table 5 Detection of siderophore production ability of SZ5 and DLJ1

3 結論與討論

在種子萌發試驗中，SZ5 和DLJ1 菌劑的各培養液處理不僅無法促進油菜和小麥種子萌發，而且NA 培養液和2 個菌劑發酵液處理還顯著延緩了種子的萌發速度。隨著種子萌發與生長，DLJ1 發酵液處理顯著促進了油菜萌發苗根、莖、葉的生長以及小麥萌發苗根系的伸長，其促生效果優于其菌懸液處理和SZ5 發酵液處理；SZ5 各處理中僅菌懸液處理對小麥萌發苗有一定的促生作用。在幼苗生長試驗中，種子萌發后再進行內生菌接種處理，培養6 d 后發現其對幼苗生長的促進作用較小。通過對2 個菌劑發酵液成分以及產Fe 載體能力進行檢測，推測DLJ1 處理促生作用優于SZ5 處理可能與其分泌的ACC 脫氨酶活性高以及具有產Fe 載體能力有關。

本研究結果表明，DLJ1 菌劑在油菜生產上可能有一定的應用前景，同時建議在萌發期進行DLJ1 菌劑處理可能效果更好。