苦參素對局灶性腦缺血再灌注大鼠血液流變學的影響及機制探討*

瞿娟娟，王雙宇，張 超，徐海發，陳惠敏，周少英，韓亞非，王朝宗，余 婷

（1．邯鄲市中心醫院東區急診科，邯鄲 056000；2．邯鄲市中心醫院腎內一科，邯鄲 056001；3．邯鄲市中醫院內科，邯鄲 056001）

隨著人口老齡化的加劇，缺血性腦血管病已逐漸發展成為致殘和死亡的主要疾病之一，盡快通過藥物溶栓或介入治療以恢復血流再灌注是挽救患者生命、降低血栓后遺癥的首要治療方案，但缺血再灌注并發癥的存在卻嚴重影響著其治療效果。缺血再灌注損傷病理機制非常復雜，其中血液流變性指標改變是其重要的病理機制之一[1-2]。苦參素（OMT）為傳統中藥品種苦參的主要有效成分之一，既往研究發現OMT能夠通過抑制繼發性神經細胞凋亡、抑制炎癥反應等而對局灶性腦缺血再灌注損傷起到一定的保護作用[3-4]，但關于OMT能否改善腦缺血再灌注后血液流變學改變的文獻報道尚不多見，本研究將通過大鼠實驗研究OMT對腦缺血再灌注后血液流變學指標的影響并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗用SD大鼠（雌雄不限）購自河北醫科大學實驗動物中心[SCXK（冀）2013-1-003]，適應性飼養1周后進行實驗。

1.2 藥物與試劑 OMT購自南京澤朗醫藥科技有限公司（批號：20170114）；蘇木精-伊紅（HE）試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司（批號：161209）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）購自上海化學試劑公司（批號：161209）；超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號：20170309、20170413、20170114）。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組與模型制備 取140只實驗用大鼠按照隨機數字表法隨機分為假手術組、模型組和OMT低[25 mg/（kg·d）]、中[50 mg/（kg·d）]、高[100 mg/（kg·d）]劑量組，每組28只。通過線栓法阻斷大腦中動脈制備局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，假手術組行手術操作但不插入栓線。術后第2天開始腹腔注射給藥治療（1 次/d），療程 7 d[8]。

1.3.2 神經功能評分 采用10分制盲法評分：置地上，向缺血對側轉圈，計1分；提鼠尾，缺血對側前肢腕屈曲計1分、肘屈曲計2分、肩內旋計3分；對側推動時阻力下降，據下降程度計1～3分；置金屬網上，據缺血對側肌張力下降程度計1～3分。

1.3.3 腦組織含水量和梗死體積 每組隨機選取6只大鼠，深度麻醉后斷頭并剝取腦組織，去除小腦和低位腦干后稱重大腦組織質量（W），110℃恒溫烘烤48 h后稱質量（D），腦組織含水量計算公式：腦含水量（%）=[（W-D）/W]×100%。每組另隨機取6只大鼠，深度麻醉后斷頭取腦，置于-20℃冷凍15 min后沿冠狀切片（厚度約2 mm），于2%的TTC染色液中避光孵育0．5 h（梗死區呈蒼白色），運用圖像分析軟件計算大腦組織梗死百分比。

1.3.4 腦組織海馬CA1區神經元形態結構 各組隨機取6只大鼠，參照1．3．3方法取大腦、多聚甲醛溶液（濃度4%）固定3 d、石蠟包埋、切片、脫蠟水化，然后行常規HE染色，封片后通過顯微鏡觀察腦組織海馬CA1區神經元形態結構。

1.3.5 抗氧化酶活性和MDA含量 各組取剩余10只大鼠，參照1．3．3方法取大鼠大腦并剝取海馬組織，研磨勻漿、3 000 rpm離心10 min取上清液，遵照試劑盒步驟處理后通過紫外-可見分光光度計測定抗氧化酶（SOD、CAT）活性和MDA含量。

1.3.6 血液流變學指標及紅細胞膜流動性指標于1．3．5斷頭取腦前，開腹并經腹主動脈取血，做抗凝處理，用R-80錐板型血液流變檢測儀測定全血黏度（低切、中切、高切）和血漿黏度，計算紅細胞聚集指數、紅細胞變性指數、紅細胞剛性指數、紅細胞壓積，測定血沉；測定紅細胞膜流動性指標：熒光偏振度、平均微黏度、各向異性。

1.4 統計學處理 運用軟件SPSS 19．0進行統計分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗，P＜0．05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OMT對局灶性腦缺血再灌注大鼠神經功能評分、腦組織含水量及梗死體積的影響 與假手術組比較，模型組大鼠神經功能評分、腦組織含水量和梗死體積均顯著升高（P＜0．01）；與模型組比較，OMT中、高劑量組大鼠神經功能評分、腦組織含水量和梗死體積顯著降低（P＜0．05 或 P＜0．01）。見表 1。

表1 各組大鼠神經功能評分、腦組織含水量及腦組織梗死體積（±s）Tab.1 Neurological function score，brain tissue water contents and brain tissue infarct volume of rats in each group(±s)

表1 各組大鼠神經功能評分、腦組織含水量及腦組織梗死體積（±s）Tab.1 Neurological function score，brain tissue water contents and brain tissue infarct volume of rats in each group(±s)

注：與假手術組比較，**P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

組別 動物數神經功能評分 腦含水量（%）腦梗死體積（%）假手術組 6 0．00±0．00 78．01±1．39 0．00±0．00模型組 6 8．35±0．87** 85．89±1．70** 28．03±2．79**OMT 低劑量組 6 8．20±1．18 84．32±2．19 24．94±3．40 OMT 中劑量組 6 6．32±0．76## 80．58±1．78# 21．62±2．59#OMT 高劑量組 6 4．79±0．50## 78．41±1．84## 18．13±2．10##

2.2 苦參素對局灶性腦缺血再灌注大鼠大腦海馬CA1區神經元形態結構的影響 假手術組大鼠海馬CA1區神經元層次清晰，排列整齊，形態完整，核膜、核仁清晰，形態結構未見異常；模型組大鼠海馬CA1區神經元呈現層次紊亂，排列稀疏、間隙增大、數量減少，胞體腫脹變形，胞核固縮或溶解等形態結構病理性改變；與模型組比較，OMT各劑量組海馬CA1區神經元病理性形態結構改變呈不同程度改善，該效果以OMT高劑量組最為顯著。見圖1。

2.3 OMT對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織抗氧化酶活性和MDA含量的影響 與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織抗氧化酶（SOD、CAT）活性顯著降低且 MDA 含量顯著升高（P＜0．01）；與模型組比較，OMT中、高劑量組大鼠海馬組織SOD、CAT活性顯著提高且MDA含量顯著降低（P＜0．05或P＜0．01）。見表 2。

2.4 各組大鼠血液流變學指標

圖1 各組大鼠大腦海馬CA1區神經元形態結構（HE，×400）Fig.1 Morphological structure of neurons in hippocampal CA1 region of rats in each group(HE，×400)

表2 各組大鼠海馬組織SOD、CAT活性和MDA含量（x±s）Tab.2 The activities of SOD，CAT and MDA in hippocampus of rats in each group±s)

表2 各組大鼠海馬組織SOD、CAT活性和MDA含量（x±s）Tab.2 The activities of SOD，CAT and MDA in hippocampus of rats in each group±s)

注：與假手術組比較，**P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

?

2.4.1 OMT對局灶性腦缺血再灌注大鼠全血黏度、血漿黏度的影響 與假手術組比較，模型組大鼠全血黏度低、中、高切均顯著升高（P＜0．05），血漿黏度顯著升高（P＜0．01）。與模型組比較，OMT 中、高劑量組大鼠全血黏度低、中、高切及血漿黏度均顯著降低（P＜0．05 或 P＜0．01）。結果見表 3。

表3 各組大鼠全血黏度、血漿黏度（x±s）Tab.3 Blood viscosity and plasma viscosity of rats in each group(±s)mPa·s

表3 各組大鼠全血黏度、血漿黏度（x±s）Tab.3 Blood viscosity and plasma viscosity of rats in each group(±s)mPa·s

注：與假手術組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

組別 動物數 全血黏度 血漿黏度低切 中切 高切假手術組 10 10．18±0．65 5．82±0．41 4．12±0．38 1．19±0．12模型組 10 12．76±1．50*6．87±0．56*5．17±0．60*1．68±0．18**OMT 低劑量組 10 12．00±1．59 6．50±0．65 4．80±0．49 1．58±0．20 OMT 中劑量組 10 11．03±1．52#5．97±0．62#4．62±0．44#1．37±0．13#OMT 高劑量組 10 10．82±1．20#5．51±0．46#4．25±0．38#1．28±0．09##

2.4.2 OMT對局灶性腦缺血再灌注大鼠紅細胞膜流動性指標的影響 與假手術組比較，模型組大鼠紅細胞聚集指數、剛性指數均顯著升高（P＜0．05），紅細胞變形指數顯著降低（P＜0．01）；與模型組比較，OMT中、高劑量組大鼠紅細胞聚集指數、剛性指數并顯著升高紅細胞變形指數均顯著降低（P＜0．05或P＜0．01）。見表 4。

2.4.3 OMT對局灶性腦缺血再灌注大鼠紅細胞壓積、血沉的影響 與假手術組比較，模型組大鼠紅細胞壓積、血沉顯著升高（P＜0．05 或 P＜0．01）；與模型組比較，OMT中、高劑量組大鼠紅細胞壓積和血沉均顯著降低（P＜0．05 或 P＜0．01）。見表 5。

3 討論

缺血再灌注損傷并發癥嚴重影響缺血性腦病患者治療效果，其病理機制非常復雜，既往病理研究發現急性缺血性腦病患者血液血液黏度增高，呈濃、黏、凝、聚狀態[5-6]，血液流變學指標均顯著高于正常對照組，表現出紅細胞變形能力下降、聚集程度升高以及血液黏度提高等指標變化[7]，血液高凝狀態將導致局部血液微循環持續惡化，進而誘發神經細胞繼發性凋亡[2，8]，為缺血再灌注損傷的重要病理機制之一。因此，通過改善血液流變學以預防梗死灶進一步擴大和二次腦梗或許是提高急性缺血性腦病患者臨床療效有效方案。

表4 各組大鼠紅細胞聚集指數、剛性指數、變形指數（±s）Tab.4 Red blood cell aggregation index，rigidity index and deformation index of rats in each group(±s)

表4 各組大鼠紅細胞聚集指數、剛性指數、變形指數（±s）Tab.4 Red blood cell aggregation index，rigidity index and deformation index of rats in each group(±s)

注：與假手術組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

紅細胞變形指數假手術組 10 2．31±0．17 4．87±0．54 1．03±0．09模型組 10 3．15±0．40* 6．21±0．94* 0．58±0．06**OMT 低劑量組 10 2．64±0．31 5．59±0．84 0．70±0．08 OMT 中劑量組 10 2．48±0．20# 5．01±0．70# 0．78±0．05#OMT 高劑量組 10 2．33±0．25# 4．68±0．53# 0．90±0．08##組別 動物數 紅細胞聚集指數紅細胞剛性指數

表5 各組大鼠紅細胞壓積、血沉（±s）Tab.5 Hematocrit and ESR of rats in each group(±s)

注：與假手術組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

組別 動物數 紅細胞壓積（%） 血沉（mm/h）假手術組 10 2．19±0．16 0．76±0．05模型組 10 3．23±0．32* 1．02±0．08**OMT 低劑量組 10 2．88±0．31 0．93±0．11 OMT 中劑量組 10 2．59±0．25# 0．85±0．07#OMT 高劑量組 10 2．37±0．20# 0．77±0．04##

苦參（Sophora flavescens Ait．）味苦、性寒，具有清熱燥濕、利水退黃、祛風殺蟲之功效。OMT是苦參的主要有效成分之一，具有抗炎、抗細胞凋亡等多種生物學活性[8-9]以及擴張血管、改善微循環等藥理學作用[11]，但OMT是否能夠改善腦缺血再灌注后血液流變學指標而起到一定保護作用的研究報道尚不多見。實驗通過制備局灶性腦缺血再灌注大鼠模型并腹腔注射給予苦參素進行干預，發現經OMT 50～100 mg/（kg·d）治療能夠有效降低腦缺血再灌注大鼠神經功能評分、改善神經功能癥狀，降低腦組織含水量，降低腦組織梗死體積，抑制腦組織海馬CA1區病變，改善海馬CA1區抗氧化酶活性（SOD、CAT）并降低MDA含量[12-13]、降低氧化應激損傷，提示OMT對腦缺血再灌注損傷具有一定的保護作用。本實驗研究發現，經OMT干預治療能夠顯著降低腦缺血再灌注大鼠全血低切黏度、全血中切黏度、全血高切黏度以及血漿黏度，降低紅細胞聚集指數、剛性指數并提高紅細胞變性指數，減低紅細胞壓積和血沉，提示OMT具有改善腦缺血再灌注損傷大鼠血液流變學、改善血液高凝狀態、改善局部微循環的作用。

總之，OMT可能通過改善血液流變學而對腦缺血再灌注損傷起到一定的保護作用。